4 Дробление

После оплодотворения начинается следующий этап в индивидуальном развитии животных – процесс дробления. Дробление – это многократные митотические деления зиготы, в результате которых зародыш становится многоклеточным. Сначала зигота разделяется на две половины, затем на четыре части, восемь частей и т. д.

Дочерние клетки, образующиеся в период дробления, называются бластомерами (от blastos – зародыш, meros – часть), а разделяющие их плоскости – бороздами дробления.

Борозды, проходящие через анимальный и вегетативный полюсы зиготы, называются меридиональными. Борозда, проходящая перпендикулярно полярной оси зиготы через ее середину, называется экваториальной; борозды, параллельные экваториальной, называются широтными; борозды, проходящие параллельно поверхности зародыша, называются тангенциальными.

Деления дробления имеют некоторые отличия от обычных митотических делений.

Во-первых, разделившиеся клетки зародыша не растут, так что суммарный объем и масса всех возникших клеток не превышают объема и массы зиготы сразу после оплодотворения (отсюда и термин – «дробление»).

Во-вторых, количество ДНК в ядрах удваивается после каждого деления, как при обычном митозе, что приводит к увеличению количества ДНК на зародыш.

Такие особенности делений дробления приводят к тому, что восстанавливаются типичные для соматических клеток ядерно-цитоплазматические отношения. Их величина резко уменьшается в ходе большого роста ооцита.

Так, у веслоногих раков ядерно-цитоплазматическое отношение ооцита до начала роста составляет 1/15, а к концу большого роста 1/1260. Для ооцитов морского ежа эти величины составляют соответственно 1/6 и 1/550

Таким образом, первая биологическая функция дробления – образование многоклеточности, а вторая – восстановление примерно тех же ядерно-цитоплазматических отношений, которые существовали у животного этого вида до периода большого роста ооцитов.

Особенности клеточных циклов при дроблении

Первые деления дробления зигот у большинства изученных животных проходят синхронно, так что число бластомеров составляет 2n, где n – число делений дробления. Продолжительность синхронного периода дробления имеет видовые различия. У моллюсков синхронны первые 3–4 деления, у разных видов насекомых – 5–12 делений, у иглокожих – 6–8 делений, у костистых рыб – 4–11 делений, у осетровых рыб – 8–9 делений, у амфибий – 11–14 делений, у птиц – 5 делений. У круглых червей, млекопитающих и некоторых других животных периода синхронных делений нет, уже первые два бластомера делятся несинхронно.

Одна из отличительных особенностей клеточных циклов в раннем развитии животных – большая частота клеточных делений. Высокая пролиферативная активность, обусловленная прежде всего укороченными клеточными циклами, характерна как для первичноротых (полихеты, моллюски, насекомые), так и для вторичноротых (иглокожие, рыбы, амфибии, птицы). Укороченные клеточные циклы в период синхронных делений дробления отличаются отсутствием пресинтетической фазы Gx. Фаза синтеза ДНК (5-фаза) занимает непродолжительный отрезок времени, удельная же доля митоза составляет, как правило, около 50 % генерационного времени, достигая в отдельных случаях 70–75 %. Главные синтетические процессы в синхронно делящихся бластомерах – синтез ДНК и гистонов.

Укорочение клеточных циклов при дроблении происходит потому, что в Сг-фазе дробящихся эмбрионов полностью отсутствует экспрессия генов, т.е. геном зародыша полностью неактивен. Все синтетические процессы, в том числе и синтез гистоновых белков, идут за счет материнских матричных РНК, накопленных еще в оогенезе. Исключение из этого правила составляют животные с асинхронным дроблением. Так, у млекопитающих некоторые гены эмбриона начинают экспрессироваться на стадии двух бластомеров.

Считается, что потеря синхронности дробления связана именно с активацией генома зародыша. В развитии всех животных наступает момент, начиная с которого темпы клеточной репродукции замедляются и происходит десинхронизация делений дробления. Преобразование структуры клеточного цикла складывается из нескольких составляющих:

- резкое увеличение длительности фазы синтеза ДНК;

- увеличение продолжительности постсинтетической фазы G2;

- возникновение и рост пресинтетической фазы Gx.

Так, у морского ежа в период от стадии дробления до стадии гаструлы генерационное время увеличивается в 20 раз, в основном за счет увеличения длительности S-фазы. Сходная картина описана у шпорцевой лягушки, аксолотля, костистых рыб, полихет, моллюсков, насекомых и др.

Изменение структуры клеточного цикла сопровождается увеличением подвижности бластомеров во время удлинившейся интерфазы и началом транскрипции собственных генов зародыша. Это явление называется переходом к средней бластуле (среднебластульный переход). Процесс этот контролируется ядерноцито-плазматическим отношением, которое постепенно увеличивается при дроблении.

Пространственная организация дробления

Характер дробления не одинаков у животных различных типов. Особенности пространственной организации дробления определяются следующими типами процессов:

1) закономерным расположением интерфазных ядер в бластомерах;

2) закономерной ориентацией митотических веретен делений дробления;

3) движениями бластомеров на различных фазах клеточного цикла.

На расположение ядер и веретен влияют количество и расположение желтка в цитоплазме яйцеклеток. Желток, будучи необходимым питательным резервом для развития зародыша, в то же время является пассивным балластом, задерживающим деление зиготы и бластомеров. Чем больше в цитоплазме желточных включений, тем медленнее делится эта часть цитоплазмы. При определенной степени перегрузки цитоплазмы желтком деление становится невозможным.

Правила зависимости между расположением желтка и положением ядер и веретен были сформулированы немецким ученым О. Гертвигом на основе правил, предложенных ранее ботаником Ю. Саксом для растительных меристем. Эти правила состоят в следующем: 1) клеточное ядро стремится расположиться в центре свободной от желтка цитоплазмы; 2) веретено клеточного деления стремится расположиться по направлению наибольшего протяжения свободной от желтка цитоплазмы.

Яйцеклетки с небольшим и средним количеством желтка (олиголецитальные и мезолецитальные) претерпевают полное (или голобластическое) дробление (от holos – целый, blastos – зародыш). Голобластический тип дробления характеризуется тем, что все содержимое зиготы входит в состав бластомеров, а зародыш развивается за счет внутриклеточной утилизации желтка. Полное дробление может быть полным равномерным (олиголецитальные яйцеклетки) и полным неравномерным (мезолецитальные яйцеклетки). Наиболее общей закономерностью голобластического дробления является взаимная перпендикулярность (ортогональность) первых трех борозд дробления.

Яйцеклетки с большим количеством желтка (полилецитальные) претерпевают неполное, или меробластическое, дробление (от tneros – часть). Меробластический тип дробления характеризуется тем, что лишь из части такой яйцеклетки формируется зародыш, а остальная часть представляет расходуемый питательный материал. Неполное дробление может быть дискоидалъным (телолецитальные яйцеклетки с большим количеством желтка) и поверхностным (центролецитальные яйцеклетки).

Характер дробления зависит не только от количества и расположения желтка, но и от ряда других факторов, в частности от характерных для каждого типа животных особенностей цитоплазмы, формы яйцеклетки и т. д. Так, дробление может быть радиальным, спиральным, билатерально-симметричным, анархичным и т. д.

У многих яйцеклеток на ранних стадиях дробления внутренние поверхности бластомеров расходятся, между ними возникает небольшая полость, которая увеличивается по мере дробления, в ней начинает накапливаться жидкость – продукт жизнедеятельности клеток. Эта полость называется бластоцелем (blastos – зародыш, koilon – полость). К концу дробления бластоцель у зародышей некоторых видов животных может достигать значительных размеров. Зародыш в конце процесса дробления называется бластулой.

Бластоцель, первый отсек внутренней среды организма, отличается по своему ионному составу от окружающей среды. Изоляция бластоцеля от наружной среды обеспечивается формированием на боковых поверхностях соседних бластомеров специализированных межклеточных контактов (плотных контактов), непроницаемых для ионов. Транспорт ионов из внешней среды в бластоцель и обратно происходит через клетки стенки бластоцеля и контролируется особенностями строения их плазматических мембран.

Строение бластулы зависит от типа дробления данной яйцеклетки, а тип дробления в значительной степени определяется количеством и расположением желтка. Рассмотрим основные типы дробления.

Полное равномерное дробление

Яйцеклетки с небольшим количеством желтка, равномерно распределенного по цитоплазме (олиголецитальные, гомолецитальные яйцеклетки), претерпевают полное равномерное радиально-симметричное дробление. В результате такого дробления развивается зародыш – целобластула. Так дробятся яйцеклетки животных, относящихся к типу иглокожих (в том числе морские ежи, морские звезды и офиуры) и подтипу бесчерепных.

Целобластула характеризуется следующими признаками:

1) форма сферическая или приближающаяся к сферической;

2) однослойная стенка, состоящая из цилиндрических или кубических клеток;

3) большой сферический бластоцель занимает центральное положение.

В зиготах морского ежа борозда первого деления дробления проходит меридионально, борозда второго деления – перпендикулярно первой и также меридионально, борозда третьего деления дробления – экваториально, отделяя четыре бластомера анимального полюса от четырех бластомеров вегетативного полюса (это называют ортогональностью борозд первых трех делений дробления). Четвертое деление в разных ярусах бластомеров происходит по-разному. В анимальном ярусе веретена деления располагаются широтно, так что бластомеры разделяются меридионально на восемь клеток одинаковой величины. Эти бластомеры называются мезомерами. В вегетативном ярусе бластомеров веретена деления располагаются меридионально и смещены к вегетативному полюсу, так что борозды проходят широтно. В результате такого деления образуются четыре крупные клетки – макромеры, а на вегетативном полюсе – четыре мелких клетки, или микромеры. При пятом делении восемь мезомеров делятся широтно и образуют два «анимальных» яруса – Ан, и Ан1, которые располагаются один над другим. Макромеры делятся меридионально и образуют восьмиклеточный ярус нюга Ahj. Микромеры также делятся и примыкают к более крупным макромерам. Борозды шестого деления во всех бластомерах располагаются широтно, борозды седьмого деления – меридионально. В результате седьмого деления дробления возникает 128-клеточный зародыш – бластула. Ранняя бластула морского ежа представляет собой полый шар, стенка которого составлена одним слоем клеток округлой формы. После 8-го деления клеточный цикл удлиняется и начинается десинхронизация делений дробления.

В ходе развития поверхность клеточного пласта бластулы увеличивается, стенка утончается, при этом длинная ось клеток располагается перпендикулярно поверхности стенки бластулы. Наружные участки боковых поверхностей соседних бластомеров соединены плотными контактами. На наружной поверхности бластомеров образуются реснички, что позволяет зародышу вращаться внутри оболочки оплодотворения. Поздняя бластула имеет пучок ресничек на анимальном полюсе (апикальный орган) и более уплощенный слой бластомеров на вегетативном полюсе, который называется вегетативной пластинкой. На этой стадии клетки начинают секретировать фермент вылупления, который растворяет оболочку оплодотворения, зародыш выходит из оболочки и становится ранней личинкой – свободноплавающей бластулой. Такая личинка держится в толще морской воды за счет биения ресничек, а от воздействия внешней среды ее защищает гиалиновая оболочка, образовавшаяся еще при оплодотворении, которая плотно прилегает к внешней поверхности клеток.

Полное неравномерное дробление

Яйцеклетки со средним количеством желтка, который неравномерно распределен вдоль анимально-вегетативной оси яйца (мезолецитальные, телолецитальные яйцеклетки), претерпевают полное неравномерное, радиально-симметричное дробление. Так дробятся яйцеклетки амфибий и осетровых рыб. В результате такого I дробления возникает зародыш – амфибластула.

Амфибластула характеризуется следующими признаками:

1) форма сферическая, стенка состоит из нескольких слоев клеток, бластоцель смещен к анимальному полюсу;

4) анимальная часть стенки бластулы (крыша бластоцеля) тоньше, чем массивная вегетативная часть стенки (дно бластоцеля);

5) анимальные бластомеры пигментированы, содержат меньшее количество желтка, чем крупные вегетативные бластомеры, и мельче их.

Для мезолецитальных яйцеклеток ортогональность борозд первых трех делений дробления выводится непосредственно из правил Гертвига-Сакса. Веретено первого деления дробления в зиготе амфибий располагается широтно под поверхностью анимального полюса. Соответственно борозда первого деления дробления проходит меридионально. Желток, сосредоточенный в вегетативном полушарии, затрудняет дробление. Борозда первого деления закладывается на анимальном полюсе и медленно распространяется на вегетативную область. Так, у аксолотля борозда дробления распространяется в анимальной области со скоростью около 1 мм/мин.

Борозда второго деления начинает закладываться вблизи от анимального полюса еще до того, как борозда первого деления дробления разделила вегетативное полушарие. Веретена второго деления расположены в той же плоскости, что и веретено первого деления, но под прямым углом к нему, поскольку эти направления примерно соответствуют наибольшему протяжению свободной от желтка цитоплазмы. Борозда второго деления дробления проходит также меридионально.

Первые четыре бластомера мезолецитальных яйцеклеток примерно равны между собой и обозначаются как квадранты яйца. Далее направление наибольшей протяженности свободной цитоплазмы в каждом квадранте совпадает с меридианами яйца, так как широтные поперечники короче меридиональных. Соответственно этому все четыре веретена третьего деления располагаются меридионально, но остаются смещенными к анимальному полюсу.

Борозды третьего деления дробления проходят широтно и смещены к анимальному полюсу. В результате образуются четыре анимальных бластомера меньшего размера и четыре более крупных вегетативных бластомера. Поскольку кортекс анимального полушария яйцеклеток амфибий и осетровых рыб содержит многочисленные меланосомы, анимальные бластомеры дробящихся зародышей имеют темную окраску. Клетки-потомки пигментированных анимальных бластомеров сохраняют окраску в течение всего раннего развития, вплоть до стадии нейрулы.

Позже дробление утрачивает общую правильность, и на последующих стадиях дробления анимальная область содержит многочисленные мелкие клетки, а в вегетативной области имеется относительно небольшое количество крупных, богатых желтком бластомеров. Зародыш амфибий на стадии от 16 до 64 клеток называют морулой по внешнему сходству с тутовой ягодой (moms – тутовое дерево). На стадии 128 бластомеров (ранняя бластула) появляется хорошо различимый бластоцель. На стадии средней бластулы после 12-го деления дробления у зародышей шпорцевой лягушки Xenopus laevis, как и у других видов амфибий, наблюдается падение митотического индекса, активация генов зародыша и увеличение подвижности бластомеров. По мере развития поверхность наружных клеток бластулы уплощается, они образуют эпителиальный слой. Зародыш перед гаструляцией называется поздней эпителиальной бластулой.

Сходным образом происходит дробление у осетровых рыб, однако синхронность дробления нарушается раньше, так как их яйцеклетки содержит чуть большее количества желтка.

Неполное дискоидальное дробление

Яйцеклетки с большим количеством желтка, который распределен неравномерно вдоль анимально-вегетативной оси яйца (полилецитальные, резко телолецитальные яйцеклетки), претерпевают неполное дискоидальное дробление. Так дробятся зиготы костистых рыб, рептилий и птиц. В результате такого дробления образуется зародыш – дискобластула.

Дискобластула характеризуется следующими признаками:

1) форма сферическая;

2) крыша бластулы имеет вид небольшого многоклеточного диска, называемого бластодиском, или бластодермой, а дно представлено объемной массой нераздробившегося желтка;

3) между бластодиском и желтком имеется узкое пространство – подзародышевая полость.

Рассмотрим дробление костистых рыб. В яйцеклетках костистых рыб после оплодотворения начинается движение цитоплазмы по направлению к анимальному полюсу, где образуется скопление свободной от желтка цитоплазмы – будущий бластодиск. Масса недробящегося желтка называется желточной клеткой. По периферии бластодиска его цитоплазма непосредственно переходит в тонкий поверхностный слой цитоплазмы желточной клетки – желточный цитоплазматический слой. Такая сегрегация цитоплазмы от остального объема яйцеклетки, занятой желтком, продолжается в течение нескольких делений дробления.

Дискоидальное дробление у костистых рыб характеризуется тем, что его первые четыре-пять борозд проходят меридионально (вертикально) и под прямым углом друг к другу. Дискоидальное дробление, как и полное неравномерное дробление, полностью отвечает правилам Гертвига-Сакса.

Борозда первого деления дробления закладывается на анимальном полюсе и распространяется вертикально по направлению к вегетативному, но разделяет только цитоплазму бластодиска, так что образовавшиеся бластомеры снизу и по периферии бластодиска не отграничены от желтка. Борозда первого деления проходит поперек длинной оси бластодиска, который имеет эллипсоидную форму при взгляде со стороны анимального полюса. Борозда второго деления дробления проходит перпендикулярно первой борозде вдоль длинной оси бластодиска. Борозды третьего деления параллельны борозде первого, а борозды четвертого деления параллельны бороздам второго. На стадии 16 бластомеров впервые появляются клетки, полностью отделенные друг от друга и от желтка, – это квартет самых центральных бластомеров. Такое полное отделение происходит в конце четвертого цикла, когда борозды деления отсекают бластодиск от центра, распространяясь к краю бластодиска. Периферические 12 бластомеров называются краевыми бластомерами. Их цитоплазма переходит непосредственно в желточный цитоплазматический слой.

У аквариумной рыбки данио (Brachydanio rerio) борозды пятого деления дробления проходят параллельно бороздам первого и третьего делений. Обычно 32 бластомера лежат на желточной клетке в виде четырех рядов по 8 клеток (4 x 8), но встречаются зародыши с менее упорядоченной картиной расположения бластомеров.

Борозда шестого деления дробления проходит горизонтально (параллельно экватору яйца), в результате этого образуется второй, внутренний ярус бластомеров, называемых глубокими клетками. Из глубоких клеток образуется непосредственно зародыш костистых рыб. Каждая глубокая клетка является одной из двух дочерних клеток четырех центральных бластомеров на 32-клеточной стадии. Другие дочерние клетки остаются поверхностными. Дочерние клетки краевых бластомеров после шестого деления становятся поверхностными клетками зародыша. У других видов костистых рыб (вьюн Misgurnus fossilis L., медака Oryzias latipes) уже борозда пятого деления дробления проходит горизонтально.

В последующем появляются тангенциальные борозды, при этом направление борозд дробления подвержено большим индивидуальным колебаниям. Деления дробления становятся «метасинхронными», поскольку в ходе каждого клеточного цикла по бластодиску проходит волна митозов. Клетки на анимальном полюсе вступают в митоз первыми, краевые бластомеры последними. Зародыш на стадии 256 бластомеров представляет собой морулу, где бластомеры образуют бугристую шапочку, возвышающуюся над желтком.

У данио после 9-го деления клеточный цикл удлиняется, наступает десинхронизация делений и появляется подвижность глубоких бластомеров. У зародышей вьюна эти процессы наблюдаются после 11 -го деления дробления.

Краевые бластомеры ранней бластулы имеют уникальную судьбу. Начиная с 10-го клеточного цикла, боковые мембраны этих клеток исчезают, а цитоплазма и ядра сливаются с желточным цитоплазматическим слоем желточной клетки. Так образуется желточный синцитиальный слой с одним рядом ядер в виде узкого кольца вокруг края бластодермы. После образования желточного синцитиального слоя клетки вышележащего яруса поверхностных бластомеров становятся краевыми, но в отличие от краевых бластомеров предыдущих стадий развития они полностью отделены мембранами от желточной клетки. Ядра желточного синцития претерпевают 3–5 метасинхронных делений, количество рядов ядер к стадии средней бластулы возрастает. К поздней бластуле часть ядер синцития перемещается под бластодерму, образуя внутренний желточный синцитиальный слой, другая часть желточного синцития спереди от края бластодермы формирует наружный желточный синцитиальный слой. Часть ядер внутреннего слоя может образовываться за счет деления самых базальных глубоких бластомеров. Желточный синцитиальный слой непосредственно не участвует в построении тела зародыша. Это экстраэмбриональное образование, имеющее важное морфогенетическое значение и обеспечивающее эпиболию бластодермы во время гаструляции.

Поверхностные бластомеры в процессе бластуляции образуют эпителиальный монослой бластодермы – покровный слой. Вначале поверхностные бластомеры делятся как в плоскости пласта, так и перпендикулярно ему. Планарные деления дают дочерние клетки, остающиеся в покровном слое, а при перпендикулярном делении одна дочерняя клетка остается в покровном слое, другая же становится глубокой клеткой. По мере развития клетки покровного слоя сильно уплощаются, покровный слой становится трудно различимым. Боковые поверхности бластомеров покровного слоя образуют плотные и промежуточные контакты, которые обеспечивают изоляцию внутренней среды зародыша от окружающей среды. Краевые бластомеры покровного слоя и прилежащие к ним участки желточного синцитиального слоя соединены плотным и следующим за ним протяженным промежуточным контактом. К стадии поздней бластулы деления бластомеров покровного слоя совершаются только в плоскости пласта, а после начала эпиболии и до ее конца число клеток покровного слоя не меняется. Клетки покровного слоя не участвуют в построении тела зародыша.

Таким образом, к стадии поздней бластулы в зародышах костистых рыб формируются три морфологически обособленных клеточных компартмента с разной судьбой – глубокие клетки, покровный слой и желточный синцитиальный слой. Трехслойная структура бластодермы – особенность, общая для всех костистых рыб.

Неполное поверхностное дробление

В яйцеклетках с большим количеством центрально расположенного желтка (полилецитальные, центролецитальные) дробление ограничено поверхностным слоем цитоплазмы. Так дробятся яйцеклетки насекомых. В результате такого дробления образуется зародыш, который называется перибластулой.

Перибластула характеризуется следующими признаками:

1) форма эллипсоидная; полости не имеет;

2) бластодерма состоит из одного-двух слоев клеток, окружающих желток.

Особенность этого типа дробления состоит в том, что обособление клеток происходит только после многократного деления ядер. После слияния пронуклеусов ядро зиготы, окруженное свободной от желтка цитоплазмой, располагается в центре. Там оно претерпевает несколько митотических делений. У дрозофилы в результате таких делений продолжительностью 8 мин каждое образуется 256 ядер. Затем ядра с окружающими их островками цитоплазмы (энергиды) мигрируют на периферию яйца. Когда во время десятого митотического цикла ядра достигают периферии, каждое из них окружается микротрубочками и микрофиламентами. При этом ядра дробления располагаются и делятся в общем поверхностном слое цитоплазмы. Эта стадия называется стадией синцитиалъной бластодермы.

Ядра, мигрирующие к заднему полюсу яйца, вскоре окружаются плазматическими мембранами и образуют полярные клетки зародыша, дающие впоследствии начало половым клеткам взрослого организма. После образования полярных клеток цитоплазматическая мембрана яйца образует впячивания (борозды дробления), которые распространяются между ядрами от поверхности к желтку. В результате каждое ядро обособляется в отдельной клетке. Возникает клеточная бластодерма. Ее клетки покрывают одним слоем богатую желтком сердцевину яйца. У дрозофилы этот слой состоит приблизительно из 6000 клеток и формируется через 3 ч после оплодотворения. У зародышей насекомых часть дочерних ядер остается в желтке и становится вителлофагами, участвующими в утилизации желтка.

Процесс обособления клеток у зародышей насекомых сопровождается увеличением продолжительности клеточных циклов и десинхронизацией делений дробления. В это же время отмечается усиление транскрипции.

Распределение клеток в бластодерме не равномерное и не случайное: клетки концентрируются на вентральной поверхности, обозначая место, где возникнут зародышевые листки. Эта область называется зародышевой полоской. Из нее образуются все клетки насекомого. Остальные клетки бластодермы образуют внезародышевые оболочки.

У некоторых низших беспозвоночных (кишечнополостные, паразитические плоские черви) наблюдается анархическое дробление, когда бластомеры слабо связаны между собой и вначале располагаются неправильными цепочками.

Часто бластомеры располагаются как при спиральном, радиальном или билатеральном дроблениях, и такие вариации анархического дробления называют соответственно псевдоспиральным, псевдорадиальным или псевдобилатеральным. Однако подобные типы укладки бластомеров являются случайными и никак не влияют на последующее развитие.

Позже бластомеры компактизуются и формируют морулу, не имеющую бластоцеля.

У моллюсков, червей и некоторых кишечнополостных в конце процесса дробления образуется зародыш со стенкой равномерной толщины и небольшим центрально расположенным бластоцелем. Такая бластула называется стерробластулой.

Контрольные вопросы

1. Какие типы дробления существуют?

2. Какие типы яйцеклеток подвергаются полному и неполному дроблению? От чего зависит тип дробления?

3. Как называются бластулы при разных типах дробления?