18.1 Генетикалық картирлеу әдістері

Генетикалық картирлеу – классикалық генетикаға негізделген картирлеу – жұптасу тобын, рекомбинация жиілігін, генетикалық картаның құрылысын, рекомбинация өлшем бірліктерін процентпен не сантиморганмен (сМ) анықталады. Цитогенетикалық картирлеу цитогенетикалық әдістермен жүзеге асады, нуклеотидті бірізділікті локальдеген де, цитологиялық препараттардың орналасуын анықтағанда қолданылады. Физикалық картирлеу – геном картасын құрайтын, локальденген нуклеотидтер бірнеше оннан мыңға дейін, бір нуклеотидті жұпқа дейін дәл арасын анықтайтын кең әдістер тобы. Соңғы уақытқа дейін картирлеуде биохимиялық полиморфозаға қатысты функционалды қадам басым болды. Мұндай картирлеу ақуыз өнімін таза түрде бөліп алуда басталады. Әрі қарай оған аминқышқылдық сәйкестілік бойынша табиғи праймерлер таңдалып, ПЦР-скрининг геномды қорына кіргізіледі. Дегенмен, бұл ақпараттарды толығымен айғақтайтын қызметтері анық, клонирленген және локальданған гендер тізімі жоғалған. Функционалды және кандидатты картирлеуге жақын. Бұл жағдайда генді анық көрсету үшін функционалды өзгерістер туралы мағлұмат жеткіліксіз, бір жағынан хромосомадағы орны туралы болжам жасауға жеткілікті. Функционалды да және кандидатты да жолмен генді клондағанда геномның нақты локальденуінен алдын алады. Ол үшін хромосомадағы локальдену функциясын зерттеу керек. Бұл жол «тура генетика» деп саналады, ол генетикалық, цитогенетикалық картирлеудің дәстүрлі әдістерімен сипатталады. Бұған дейін басқа әдіс іс-жүзінде мүмкін болмады.

Генетикалық картирлеу. Осыған дейін адамдар мен сүтқоректілердің геномын зерттеу генетикалық анализ әдісі-генетикалық карта не жұптасу картасын (linkage map) құру арқылы ғана мүмкін еді. Генетикалық картаны құру үшін бірінші гендік жұптасу топтарының қалыптасуын, олардың орналасу жағдайын зерттеу керек. Жұптасу картасын қүрудың негізгі әдісі классикалық генетикалық анализ, яғни мейозадағы гендік локустің рекомбинация жиілігін зерттеу. Жұптасу картасы геннің ұрпақтық орналасу кезеңін және хромосомадағы маркерді, рекомбинация процентпен– сантиморган (сМ) арқылы көрсетілген олардың арасындағы генетикалық арақашықтықты  көрсетеді. Хромосомадағы екі ген 1 сМ арақашықтықта орналасады, егер рекомбинация мүмкін болса, олардың арасындағы мейоза процесі 1 %-ы құрайды. Генетикалық жұптасу картасы ерлер үшін 2809 сМ, ал әйелдер үшін 4782 сМ. Ерлердің «өлшемі» рекомбинция жиілігі оогенезге қарағанда сперматогенезде аз. Адам геномының орташа ұзындығы 3300 сМ. Мұны адамның гаплоидты генімен салыстырсақ 2,91 млрд.н.ж. деп жуық бағалаймыз, 1сМ генетикалық картаға орташа 1 млн.н.ж. ДНК физикалық карта геномы сәйкес келеді. Дегенмен, рекомбинация жиілігі геномның әр нүктесінде әртүрлі, бұл өлшемдер өзгеруі мүмкін, нәтижесінде жұптасу картасында хромосомада маркер мен ген арасында физикалық арақышықтықты бермейді.

ХХ ғ. 70 ж. адамның генетикалық картасын құру өте баяу бет алысқа ие болды. Бір ұрпақ өкілдерінің ұзақ периоды, ақпараттың жетіспеушілігі, өнімді цитогенетикалық анализдің болмауы адам хромосомаларын мақсатты түрде картирлеуді қиындатты. 1911 ж. ең алғаш адам гені Х-хромосомаға локальденді, ал бірінші аутосомалық ген – тек 1968 ж. локальденді. 70 ж ортасында адам хромосомасында 100-ге жуық гендер локальденді, белгілі бір бөлігі Х-хромосомаға. Адам геномын картирлеуде маңызды процесс адамның мұрагерлік әртүрлі ауруларын түрлендіре алатын жануарлардың мутантты генетикалық түріне байланысты (көп аса тышқандар мутанттары). Эмбриональды бойлық жасушаларды мәденилендіруде экспериментальдық негіздер жақсы жасалды – генді арнайы бұзу сайты не оларға белгілі бір мутантты аллельдерді in vitro енгізу, генетикалық модификациялық клондар таңдау және оларды бастапқы ұрықтарға отырғызу. Осындай әдістер нәтижесінде жануарлар ұрпағын, әсіресе тышқандардың белгілі генге мутациялануын анықтауға болады. Қазіргі таңда эксперименттік жануарлар генін локальдеу және иденфицирлеудің айтарлықтай тиімді әдістері жетілдірілген. Адам мен сүтқоректілердің гомологтық гендерінің ұқсастығының жоғары дәреже көрсетуі, сонымен қатар, синтезді жұптасу топтарының көп сандары модельді объектілерге параллель зерттеулер жүргізуге мүмкіншілік тудырады, ол адамның индивидуалды генінің картирленуі мен молекулярлық сараптамаларын тездетеді.

Генетикалық картирлеу саласындағы одан әрі даму процесстері мәдени жасушалық банкілерді қалыптастырған ірі ғылыми-зерттеу тобының қызметімен байланысты. Адам Полиморфизмін зерттеу орталығында – СЕРН мәдени жасушалық ширату жинағын құрды. Он және жүз индивидумдар алынған ата тегінің көп сатылылығында, отбасының әртүрлі мүшелерінен алынған. Мұны Эпштейн-Барра вирусын трансформациялау арқылы алды. Мұндай лимфалық жасушалар мәдени жағдайда шексіз өсуге қабілетті. СЕРН мұрагерлік ұқсастықтарды зерттеуде идеалды генетикалық зерттеу жүйесіне ие. Бұл коллекциялар барлық елде адам генін және әртүрлі типті маркерлерді локальдауда кеңінен қолданылды. Зерттеу нәтижелерінде генотип мүшелері анықталып, сәйкес генетикалық қарсы құрастырылды. Бұл линиядағы жасушалық клондар не ДНК үлгілері жұптасу гендерінің бөлектену анализдерінде не сипатталған полиморфты локустарға қолданылады. Осы салада соңғы 30 жылда Балтимордағы Джон Хопкинс Университетінің профессоры Виктор Мак-Кьюсиканың еңбектері өте үлкен рөл ойнады. Бұл зерттеулер нәтижелері систематикалық публикациялары болып табылады. Энциклопедия атауы: «Адамзаттың Менделеевтік мұрасы: адам генінің және генетикалық аурулардың жинағы» («Mendelian inheritance in men. Catalog of autosomal dominant, autosomal recessive, and X-linked phenotypes»). Компьютерлік дерекқордың пайда болуы мен дамуы картирлік анализдің жаңа дәрежеге жетуіне әкелді.

Қазіргі таңда адам, тышқан, ауыл шаруашылығы жануарларының және т.б. көптеген ағзалар хромосомасының генетикалық картасы құрастырылған. Цитогенетикалық картирлеу. Сонымен осы жылдары цитогенетикалық салада да метафазалық хромосомалардың дифференциалды боялу маңыздылығымен байланысты үлкен жетістіктерге қол жеткізілді. Дифференциалды бояу әдісі хромосоманы препаратта жекелей және кез-келген бөлігін иденфицирлей алып, бэндтерді ашады. Метафазалық хромосомада аз дәрежеде 750-ге жуық бэнд иденфицирленеді, метафаза аралық хромосомаларда 2500–3000. Бүгінгі таңда интерфазалық және метафазалық хромосомаға арналған түрлі-түсті бояулар әдісі multicolor banding (25 түске дейін) жасалды. Цитогенетикалық карта маркердің белгілі бір хромосомаға дейін локальденуін көрсетеді. Бұл карта типі хромосомадағы маркерлердің сызықты ретін көрсетеді. Өзінің қабілеттілігіне байланысты физикалық карта мен генетикалық карталар арасында аралық күйге ие. Цитогенетикалық карта геннің орналасуын оның вариабельділігін ескермей анықтайды, онда генетикалық картаның құрылысы аллельді полиморфа локустарынан тәуелді болады. Цитогенетикалық карта басқа физикалық карталардың дамуына жол ашады, маркерлер орналасқан негізгі «қаңқа» картаны береді. Сүтқоректілердің цитогенетикалық картасын құру үшін бірнеше әдістер бар. Маркерлердің хромосомалық және субхромосомалық локализациясын анықтау үшін әртүрлі не гибридизацияға қабілетсіз in situ сүтқоректілер арасындағы гибридті соматикалық жасушаларды қолдану арқылы анықтайды. Негізгі әдісі – хромосомалық сортинг (ағынды цитометрия), микродиссекция және белгілі бір геномды фрагменттерді микроклонирлеу, салыстырмалы генетикалық картирлеу (салыстырмалы цитогенетика).

Физикалық картирлеу. Генетикалық картаға қарағанда жұптасу топтарына негізделіп құрылған, ДНК-маркерлер мен гендер арасының арақашықтығын статистикалық сипаттайды, ол хромосомадағы әр маркер арасының физикалық арақашықтығын анықтайды. Физикалық картирлеу әдістеріне – шектеулі картирлеу, RH-картирлеу, ҮАС клондау (yeast artificial chromosome), ВАС (bacterial artificial chromosome), космидте, плазмидте, басқа векторларда картирлеу, олардың негізінде контиг-картирлеу, ДНК-ны секвенирлеу. Жасанды хромосомаларды қолдану физикалық картирлеу әдісін хромосомалық та, субхромосомалық та дәрежеде жүргізуге мүмкіндік береді. Физикалық картирлеу негізі физикалық картаны құру, яғни ДНК молекулаларынан физикалық маркерлердің орналасу ретін анықтау. Физикалық маркер ретінде геннің өзі де, анонимді фрагменттер ДНК (D-сегменттер), ДНК –ның рестриктазамен ыдырау нүктесі бола алады.

Адамның ДНК геномының клондарымен бүркемеленген адам хромосомасының контиг-картасы. Бұл бүркемеленген клондармен карта құрудың ең жоғарғы бір әдісі. Контиг карта (contiguous – созылған) – ДНК геном фрагменттернің бүркемеленген клондарының жиыны, олар бүркемелену ретін хабарлайды. ПЦР –анализ, секвенирлеу локальдері белгілі ДНК үлгілерін гибридтеу әдісін қолдана отырып клондалған фрагментті локальдауға болады. Қазіргі таңда контигті құру адам геномының физикалық картасын құруға ұқсас. Бұл әдіс нәтижелері маркерлердің салыстырмалы орналасу орны мен олардың арақашықтығы туралы ақпарат береді, сонымен қатар, әр картирлеудің қол жетімділігі ДНК фрагментінің құрылысын құруға, нуклеотидті реттілікті түсіндіруге, қызметін анықтауға мүмкіндік береді.

Бытыралы мылтық әдісімен картирлеу (ShotGun) және кездейсоқ STS пайдалану  арқылы картирлеу. Бұл картирлеу стратегиясы қысқа кездейсоқ адам геномының фрагменттерін секвенирлеуге, оған ПЦР-праймерді таңдауға, яғни STS құруға негізделген. Радиационды жасуша гибридтерін не басқа да жүйелерді, соматикалық гибридтерді, полиморфалық маркерлерді СЕРН пайдалана отырып адам геномының физикалық және генетикалық картасында STS орналасуын анықтауға болады. Кемшілігі – STS - маркерлердің шынайы арақашықтығын анықтай алмайды, сондықтан бұл картаны қолдану шекті түрде. Мысалы, геном аймағы үшін өлшемі 10 млн.н.ж. 20 STS-маркер белгілі. Алынған картаның рұқсат етілген мөлшері 0,5 млн.н.ж. деп санауға болады, дегенмен ол шындық бола алмайды. Он маркер бір-біріне соншалықты жақын орналасуы мүмкін, аумақта ұзындығы 10 трил.н.ж. бар делік, сонда картаның рұқсат мөлшері 1 млн.н.ж. ғана құрайды. Екі STS арасын анықтау өте қиын, оны ешкім дәл анықтай алмайтынын айта кету маңызды. Немесе миллион нуклиотид жұбы екі маркерді бөліп тұрады. Бұл геном аумағын толық жабу үшін STS-тің артық мөлшерін қажет етеді.