Лабораторная работа № 7 Количественный учет микрофлоры воздуха и воды. Определение микробного числа

Цель работы: Провести количественный учет микроорганизмов воздуха и воды.

Задачи

1. Изучить методы количественного учета микрофлоры воздуха и воды.

2. Провести микробиологический анализ воздуха и санитарно-бактериологическое исследование воды.

Материалы и оборудование. Чашки Петри со стерильным МПА, стерильные пипетки на 1 мл, водяная баня, электроплитка, термометр, вода водопроводная, вода из водоема, спиртовка, спички.

Основные понятия. Общее микробное число воды, общее микробное число воздуха, коли-индекс, коли-титр, санитарно-показательные микроорганизмы, автохтонная микрофлора, аллохтонная микрофлора, зоны сапробности.

Краткие теоретические положения. Оценка санитарного состояния воздуха производственных помещений.

Воздух производственных помещений может стать источником микробного загрязнения молочных продуктов.

Санитарно-гигиеническая оценка воздуха производственных помещений проводится по двум микробиологическим показателям: общей бактериальной обсемененности (КМАФАнМ) и содержанию санитарно-показательных микроорганизмов – гемолитических стрептококков и стафилококков. Воздух производственных помещений считается чистым, если КМАФАнМ не превышает 1500 КОЕ/м3, а гемолитических стрептококков и стафилококков не более 16 в 1 м3. В качестве питательных сред используют мясопептонный агар (для определения КМАФАнМ) и кровяной агар (для определения гемолитических стрептококков и стафилококков).

Для определения микроорганизмов в воздухе используют седиментационный и аспирационный методы.

Седиментационный метод основан на самопроизвольном оседании пылинок и капель вместе с микроорганизмами на поверхность плотной питательной среды в открытых чашках Петри.

Аспирационный метод заключается в принудительном оседании микроорганизмов из воздуха на поверхности плотных питательных сред. Осуществляется аспирационный метод с помощью специальных приборов (например, прибора Кротова), снабженных вентиляторами, которые засасывают воздух в прибор через клиновидную щель. В приборе воздух ударяется о поверхность плотной питательной среды в открытой чашке Петри.

Помимо нормируемых микробиологических показателей в воздухе производственных цехов и холодильниках на предприятиях пищевой промышленности определяют наличие спор микроскопических грибов и дрожжей, произвольно оседающих на поверхности сусло-агара или среды Сабуро за 5 минут. Посевы культивируют при комнатной температуре в течение 5-и суток. Санитарно-гигиеническая оценка проводится по 3-х бальной шкале. Состояние воздуха отличное, если в посевах споры грибов и дрожжей не обнаружены; хорошее, если на поверхности среды оседает до 2 спор грибов, а споры дрожжей не выявлены; удовлетворительное, если в чашках Петри после культивирования вырастает не более 5-и колоний грибов и 2-х колоний дрожжей.

Для снижения бактериальной обсемененности воздуха на предприятиях молочной промышленности проводят проветривание и влажную уборку помещений.

Микробиологическое исследование воздуха седимен-тационным методом

Определяют количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) и содержание микроскопических грибов и дрожжей.

Для каждого определения готовят по 2 чашки Петри с 10–15 см3 мясопептонного агара или среды для определения КМАФАнМ и сусло-агара или среды Сабуро. Чашки переносят в исследуемое помещение и помещают на развернутую бумагу, в которой они стерилизовались. Далее сдвигают крышки на самый край бортика чашки так, чтобы вся поверхность агаризованной среды была открыта полностью.

Чашки оставляют открытыми 5, 10 или 15 минут (время экспозиции) в зависимости от загрязненности воздуха. Затем их закрывают крышками, переворачивают вверх дном и помещают в термостат. Чашки с МПА выдерживают в течение 24–48 часов при 37 С, а со средой Сабуро – в течение 2–3 суток при 25 С.

Подсчет колоний производят визуально и с помощью лупы. Подсчет колоний грибов и дрожжей ведут отдельно. Для определения содержания микроорганизмов в 1 м3 пользуются формулой, предложенной Омелянским, согласно которой на поверхности чашки площадью 100 см2 оседает в течение 5 минут столько микроорганизмов, сколько их содержится в 10 л воздуха.

Формула Омелянского:

Х = а×100×5×100 / ST,

где а – число выросших в чашках колоний (среднее из двух);

S – площадь чашки Петри, см2;

Т – время экспозиции, мин;

100 – пересчет площади чашки на 100 см2;

5 – время экспозиции по Омелянскому, мин;

100 – пересчет на 1 м3 воздуха.

Ход работы:

Задание 1. Заложить опыт по определению ОМЧ (общее микробное число) воздуха.

Для заражения чашки Петри открывают в исследуемом помещении или на улице на 5 мин. Крышку чашки Петри снимают и, не переворачивая, ставят рядом. На крышке чашки Петри указывают вариант опыта, дату посева. Зараженные чашки Петри помещают в термостат при температуре 25–28 С.

На втором занятии студенты исследуют:

- посевы воздуха на мясопептонном агаре и на среде Сабуро.

Через 2–3 суток подсчитывают число колоний микроорганизмов, развившихся на агаровой пластинке чашки Петри. При этом учитывают следующее: по приблизительным подсчетам (Омелянский) на площади в 100 см2 в течение 5 минут оседает столько микроорганизмов и спор, сколько их содержится в 10 л воздуха. На основании результатов исследований делаются выводы о санитарном состоянии и качественном составе микрофлоры воздуха. Этот метод дает лишь приблизительные данные, но относительное число микроорганизмов в воздухе разных помещений он позволяет обнаруживать довольно точно. Заполняют таблицу 5, делают выводы.

Таблица 5 – Общее микробное число (ОМЧ) воздуха помещений.

Колонии микроорганизмов, выделенные из воздуха на пластинках МПА, могут быть использованы для работы по идентификации вида. Наиболее часто из воздуха выделяются колонии микрококков, сарцин, некоторых бацилл и бактерий.

Оценка санитарного состояния воды

Вода, используемая на предприятиях пищевой промышленности, должна отвечать требованиям СанПиНа 2.1.4.1074-01 на питьевую воду.

Для оценки санитарного состояния воды в ней определяют общее микробное число – не более 50 КОЕ/см3; термотолерантные колиформные бактерии – не допускаются в 100 см3; общие колиформные бактерии также должны отсутствовать в 100 см3; споры сульфитредуцирующих клостридий - не допускаются в 20 см3; колифаги – в 100 см3. Исследование питьевой воды проводят один раз в квартал при пользовании городским водопроводом и один раз в месяц при наличии собственных источников водоснабжения в воде.

Общее микробное число воды (ОМЧ) – количество мезофильных аэробных и факультативноанаэробных микроорганизмов, способных образовывать колонии на питательном агаре при плюс 37 0С в течение 24 часов.

К общим колиформным бактериям относятся грамотрицательные не образующие спор палочки, не обладающие оксидазной активностью, ферментирующие лактозу или маннит с образованием альдегида, кислоты и газа при температуре плюс 37 0С в течение 24 часов.

Термотолерантные колиформные бактерии обладают всеми признаками общих колиформных бактерий, которые, кроме этого способны ферментировать лактозу до кислоты и газа при температуре плюс 44 0С в течение 24 часов.

Сульфитредуцирующие клостридии (преимущественно Clostridium perfringens) – спорообразующие анаэробные палочковидные бактерии, редуцирующие сульфит натрия на железо-сульфитном агаре в течение 24 часов при температуре плюс 44 0С.

Колифаги – бактериальные вирусы, способные лизировать кишечную палочку и формировать зоны лизиса через 18±2 часа при температуре плюс 37 0С на ее газоне на питательном агаре. Колифаги – индикаторы очистки питьевой воды в отношении энтеровирусов.

Способами обеззараживания воды являются хлорирование, озонирование, обработка ультрафиолетовыми лучами.

Микробиологическое исследование воды

Отбор проб

Кран или край спускной трубы обжигают зажженным ватным тампоном, пропитанным спиртом. Открывают кран и в течение 10–15 минут воду спускают, после чего производят отбор пробы в стерильную колбу (объем пробы не менее 500 см3). Колбу закрывают ватно-марлевой пробкой над огнем.

Посевы водопроводной воды на мясопептонном агаре и среде Кесслера.

Подсчитывают количество выросших колоний на мясопептонном агаре. Если в чашках выросло более 50 колоний, то санитарное состояние воды неудовлетворительное. Внимательно рассматривают посевы воды на жидкой накопительной среде (лактозо-пептонной среде или среде Кесслера). Если на среде есть рост, то лаборанты к занятию делают пересев на среду Эндо. Студенты рассматривают посевы в чашках Петри на среде Эндо и при наличии типичных колоний готовят фиксированные мазки, окрашивают их по Граму. Если в мазках при микроскопии с объективом на х90 обнаруживаются грамотрицательные мелкие палочки, располагающиеся по одиночке, без спор, то считают, что в исследуемой пробе воды присутствуют кишечные палочки и делают вывод о том, что исследованная вода не соответствует требованиям СанПиНа и в 100 см3 воды обнаружены общие колиформные бактерии.

Задание 2. Заложить опыт по определению ОМЧ воды.

Для исследования в стерильные колбы берут водопроводную воду. Из колбы берут стерильной пипеткой 1 мл воды и вносят в чашку Петри с расправленной средой (МПА) (температура ее не должна быть выше 45 °С). Чашку закрывают и, осторожно наклоняя, перемешивают питательную среду, дают пластинке застыть, помещают в термостат. Через 3–5 суток развившиеся в чашках Петри колонии подсчитывают и определяют количество бактерий в 1 мл воды.

После подсчета колоний производится определение микробного числа воды – количества микроорганизмов на 1 мл исследуемой воды, учитывая разведение, если оно производилось.

Данные оформляют в виде таблицы 6, делают выводы.

Таблица 6 – Общее микробное число (ОМЧ) питьевой воды

Контрольные вопросы

1. Особенности микрофлоры воздуха. Распространение микроорганизмов в воздухе.

2. Нормы санитарного состояния воздуха помещений.

3. Санитарно-микробиологическое исследование воздуха.

4. Микрофлора питьевой воды.

5. Микрофлора природных вод. Распределение микроорганизмов в воде.

6. Санитарные показатели питьевой воды. Общее микробное число воды. Коли-индекс, коли-титр воды.

7. Загрязнение и самоочищение водоемов. Роль микроорганизмов в процессах самоочищения водоемов.

8. Биологическая очистка питьевых и сточных вод.

9. Санитарно-бактериологическое исследование воды. Определение ОМЧ, коли-индекса, коли-титра.

10. Санитарно-показательные микроорганизмы воздуха, воды, почвы.