Лабораторная работа №1 Приготовление и стерилизация питательных сред, посуды для проведения микробиологического анализа

Цель работы: ознакомиться с требованиями, предъявляемыми к питательным средам, с различными классификациями и химическим составом питательных сред, правилами их приготовления и целью использования. Приобрести навыки подготовки посуды для проведения микробиологических исследований. Ознакомиться с различными способами стерилизации питательных сред, посуды, инструментов, с устройством парового стерилизатора и принципом его работы.

Оборудование, материалы: паровой стерилизатор; сушильный шкаф; посуда: чашки Петри; градуированные пипетки на 1 мл, пробирки, плоскодонные конические или круглодонные колбы разного объема; штатив для пробирок; ватно-марлевые пробки; пергаментная бумага; ножницы; вата, нитки, марля, агар-агар; сухие питательные среды: среда Сабуро, мясопептонный агар (МПА), среды Кесслера, Эндо и др.

Краткие теоретические положения. Питательные среды

Разнообразные питательные вещества, в которых нуждаются микроорганизмы и которые используются ими для синтеза основных компонентов клетки, роста, размножения и для получения энергии называются питательными веществами, а среда, содержащая питательные вещества, является питательной средой.

По типу питания микроорганизмы, которые встречаются в пищевых продуктах, относятся к хемоорганогетеротрофам. Это значит, что органические вещества, содержащиеся в питательной среде, являются источником углерода, энергии и электронов.

Потребности микроорганизмов в тех или иных органических веществах зависят от их видовой принадлежности, и, следовательно, от наличия в клетках и активности соответствующих ферментных систем.

В качестве источника углерода микроорганизмы используют углеводы, органические и аминокислоты, спирты, липиды и т.д. Как правило, лучше усваиваются низкомолекулярные органические соединения. Высокомолекулярные органические вещества могут быть использованы для питания только теми микроорганизмами, которые способны синтезировать соответствующие гидролитические экзоферменты. Органические вещества и вода являются также основными источниками водорода и кислорода.

Источником азота для хемоорганогетеротрофов могут быть различные органические и минеральные соединения: белковые вещества, пептоны, аминокислоты, соли аммония, нитраты.

В среде обязательно должны присутствовать макроэлементы (Р, S, Ca, Mg, K, Fe, Na, Cl), которые вносятся в питательную среду в виде катионов питательных солей.

Микроэлементы чаще всего нет необходимости специально вносить в среду, так как большинство микроэлементов является примесью солей макроэлементов или попадают в среду с частицами пыли, из стеклянной посуды или в составе водопроводной воды.

Для многих микроорганизмов нужны в малых дозах факторы роста. Факторы роста обязательно вносят в среды для культивирования ауксотрофных микроорганизмов (микроорганизмов, которые не способны синтезировать сами те или иные органические вещества, которые необходимы для роста и развития), а также добавляют в питательные среды в малых количествах для ускорения роста микроорганизмов, способных эти вещества синтезировать самостоятельно.

К факторам роста относятся отдельные аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, жирные кислоты, витамины и др., а также природные субстраты, содержащие эти соединения (морковный сок, кукурузный экстракт, автолизат дрожжей, гидролизаты растительного сырья и т.д.).

Питательные среды имеют исключительное значение в микробиологии. Правильный подбор питательной среды обеспечивает возможность выделения микроорганизмов из мест обитания, получения накопительных и чистых культур, изучения их морфологии и биохимических особенностей, способствует быстрой и правильной диагностике инфекционных заболеваний, дает возможность для количественного учета микроорганизмов в различных объектах (в пищевых продуктах, в воздухе, в воде, почве).

С помощью питательных сред получают также биомассу полезных для народного хозяйства микроорганизмов и биологически активные целевые продукты.

Требования, предъявляемые к питательным средам

1 В среде должны быть все необходимые для роста и развития химические элементы;

2 Среда должна быть сбалансирована по химическому составу. Это значит, что соотношение химических элементов питательной среды и главным образом соотношение органогенных элементов - С:N должно примерно соответствовать этому соотношению в клетке;

3 Среды должны иметь достаточную влажность, обеспечивающую возможность диффузии питательных веществ в клетку. Для грибов эта влажность обеспечивается содержанием влаги в субстрате не менее 12 %, для бактерий – не менее 20 %.

4 Среда должна иметь определенное значение рН среды. Среди микроорганизмов различают ацидофилы (кислотолюбивые микроорганизмы), алкалофилы (щелочелюбивые микроорганизмы) и нейтрофилы (лучше всего растут в нейтральной среде с рН около 7,0). К ацидофилам относятся грибы и дрожжи. Большинство бактерий – нейтрофилы, для которых активная кислотность среды около 4 ед. рН является губительной. Следует помнить, что при стерилизации среды и в процессе культивирования микроорганизмов, кислотность среды может сильно изменяться. Во избежание изменения рН в среду добавляют буферные системы (например: фосфатный буфер), СаСО3 (для нейтрализации образующихся в результате культивирования органических кислот), вещества органической природы, обладающие буферными свойствами (например: аминокислоты, полипептиды, белки) и др.;

5 Среды должны быть изотоничными для микробной клетки, т. е. осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки.

6 Среды должны обладать определенным окислительно-восстановительным потенциалом (rh2), определяющим насыщение ее кислородом. По шкале от 0 до 41 этим индексом можно обозначить любую степень аэробности: насыщенный кислородом раствор обозначают rh2=41, насыщенный водородом rh2=0. Облигатные анаэробы размножаются при rh2 не выше 5, аэробы – не ниже 10.

7 Среды должны быть стерильными, что обеспечивает рост чистых культур микроорганизмов.

Классификация питательных сред

По консистенции питательные среды делятся на жидкие, плотные и сыпучие.

Жидкие среды применяются для накопления биомассы или продуктов обмена микроорганизмов, для обновления долго хранящихся культур, для поддержания и хранения тех чистых культур, которые плохо растут на плотных средах.

Плотные среды необходимы для выделения и описания культуральных свойств чистых культур микроорганизмов, так как на них можно получить изолированные колонии (колония – популяция микроорганизмов, выросших из одной клетки). Плотные питательные среды используются также ля количественного учета микроорганизмов в пищевых продуктах, других объектах внешней среды и для хранения чистых культур.

Плотные среды готовятся из жидких путем добавления гелеобразующих веществ: агар-агара, желатина, геля кремнекислого (силикагеля).

Лучшим гелеобразующим веществом является агар-агар, получаемый из водорослей. Это сложный полисахарид, который образует гель с точкой плавления 96–100 0С и температурой застывания около 40 0С. Поэтому на агаризованных средах можно культивировать почти все микроорганизмы. Кроме того, агар-агар очень редко используется микроорганизмами в качестве питательного субстрата. Для уплотнения жидкой среды в нее вносят в зависимости от степени очистки от 1,5 до 2,5 % агар-агара.

В отличие от агар-агара желатин – это вещество белковой природы, которое получается из костей и хрящей животных при их вываривании, поэтому многие микроорганизмы используют желатин в качестве питательного субстрата и к концу культивирования среда с желатином разжижается. Ограниченное использование желатина в качестве уплотнителя для плотных питательных сред связано также с тем, что по сравнению с агар-агаром он образует менее прочный гель, который плавится при 23–25 0С и застывает при 20 0С, в то время как большинство микроорганизмов развивается при температуре от 25 0С до 37 0С.

Если требуется получить плотные среды, не содержащие, органических компонентов, или синтетические среды с определенным количественным и качественным составом, то в качестве уплотнителя применяют кремнево-кислый гель. Получают его путем смешивания равных объемов соляной кислоты с удельной массой 1,1 и жидкого стекла (Na2 SiO3 или К2 SiO3) с последующей разливкой по 25–30 мл в чашки Петри и выдержкой 1–2 ч.

Сыпучие среды применяют в основном в промышленной микробиологии. К таким средам относятся разваренное пшено, отруби, кварцевый песок, смоченный питательным раствором. Такие среды используются для культивирования аэробных микроорганизмов.

По происхождению и составу питательные среды делятся на натуральные (естественные), синтетические (искусственные) и полусинтетические.

Натуральные среды готовятся из продуктов животного и растительного происхождения. Они содержат все ингредиенты, необходимые для роста и развития микроорганизмов. Основным недостатком этих сред является то, что они имеют сложный и непостоянный состав. Натуральные среды используют для выращивания микроорганизмов, накопления биомассы, хранения чистых культур, но они мало пригодны для изучения обменных процессов микроорганизмов. Такими средами являются отвары злаков, трав, овощные и фруктовые соки, различные экстракты, мясной бульон, автолизат дрожжей, молоко, молочная сыворотка, гидролизаты из растительного сырья и т. д. Наиболее часто применяемыми натуральными питательными средами являются мясопептонный агар (МПА) и мясопептонный бульон (МПБ), предназначенные для культивирования бактерий, а также не охмеленное пивное сусло и сусло-агар, используемые для выращивания и накопления биомассы грибов и дрожжей.

Синтетические среды имеют в своем составе химически чистые органические и неорганические соединения в строго указанных концентрациях. По набору компонентов синтетические питательные среды могут быть сложными (среды для выращивания молочнокислых бактерий) и довольно простыми. Такие среды применяются для исследования обмена веществ, выяснения закономерностей роста или биосинтеза какого-либо метаболита и т.д. Наиболее часто в практической работе используют синтетическую среду Чапека для выращивания грибов и среду Ридер для дрожжей. Состав этих сред приведен в приложении А. Основным недостатком синтетических сред является то, что на таких средах микроорганизмы очень долго растут.

Полусинтетические среды в своем составе содержат химически чистые органические и неорганические вещества, (как и в синтетических средах) и вещества растительного или животного происхождения в качестве факторов роста для ускорения роста и развития микроорганизмов. Цель использования полусинтетических сред та же, что и синтетических.

По назначению среды делятся на универсальные (основные), избирательные (накопительные, элективные) и дифференциально-диагностические.

Универсальные среды используются для выращивания многих видов микроорганизмов. К универсальным средам, используемым для выращивания бактерий, относятся мясопептонный агар и бульон (МПА, МПБ), среда для определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (среда для определения КМАФАнМ). Грибы и дрожжи хорошо растут на не охмеленном пивном сусле, сусло-агаре (СА), среде Сабуро.

Избирательные среды обеспечивают развитие только определенных микроорганизмов или группы родственных видов и непригодны для роста других. В такие среды, как правило, добавляют вещества, избирательно подавляющие развитие сопутствующей микрофлоры. Избирательные среды применяют для выделения определенных микроорганизмов из мест их естественного обитания и для получения накопительных культур. В качестве накопительных питательных используют, например, жидкие среды Кесслера (используется для накопления бактерий группы кишечной палочки), Мюллера и Кауфмана (для выявления сальмонелл). Элективными средами могут быть плотные питательные среды, такие как молочно-солевой агар (МСА) и желточно-солевой агар (ЖСА) – для выявления и количественного учета в пищевых продуктах коагулазоположительных стафилококков, кровяной агар – для выявления гемолитических стрептококков, агар с гидролизованным молоком и мелом – для количественного учета молочнокислых бактерий.

Дифференциально-диагностические среды используются для определения видовой принадлежности исследуемого микроба, основываясь на особенностях его обмена веществ. Состав этих сред позволяет четко выделить наиболее характерные свойства изучаемого микроорганизма. Примером таких сред является плотная среда Эндо, применяемая для определения бактерий группы кишечной палочки, в состав которой входит лактоза, насыщенный спиртовой раствор фуксина, обесцвеченного перед добавлением в среду 10 % водным раствором сульфата натрия (образуется бесцветная фуксин-сернистая кислота. Кишечная палочка на такой среде ферментирует лактозу с образованием альдегидов, вследствие чего бесцветная фуксин-сернистая кислота переходит в фуксин-сернистое соединение с образованием фуксина, который окрашивает колонии кишечной палочки в красный цвет с металлическим блеском.

Виды питательных сред представлены в приложении А.

Методы стерилизации питательных сред, посуды, инвентаря. Стерилизация является одним из важнейших и необходимых приемов в микробиологической практике. Стерилизацией или обеспложиванием (sterilis – бесплодный) называется полное уничтожение микроорганизмов в питательных средах, посуде и других объектах.

Стерилизация должна обеспечивать уничтожение всей микрофлоры, патогенной и непатогенной, присутствующей в данном объекте. Она не должна приводить к порче материала или изменению его физического или химического состояния. Поэтому в зависимости от физических свойств стерилизуемых объектов и цели стерилизации применяют различные методы обеспложивания: горячие (влажная, дробная, сухая стерилизация) и холодные (механическая стерилизация, ионизация, стерилизация ультразвуком, ультрафиолетовыми лучами). Основное значение имеет тепловое воздействие на объект.

Методы стерилизации

Цель занятия: ознакомить студентов с сущностью методами, средствами и правилами стерилизации.

Задания

1. Ознакомиться с методами стерилизации.
2. Заполнить форму № 1, указать режим стерилизации в автоклаве для каждого материала.
3. Заполнить форму № 2, указав основные дезинфицирующие вещества.
4. Подготовить посуду и другие материалы.

При производстве пищевых продуктов (хлебобулочных, кисломолочных и т.д.) биологических активных веществ (антибиотиков, витаминов, ферментов, аминокислот, органических кислот и т.д.) применяют чистые культуры микроорганизмов.

Чистые культуры имеют важное значение для изучения биологических, физиологических и биохимических свойств микроорганизмов, применяемых в производстве продуктов. Присутствие же посторонних микробов может ослабить активность основной культуры, ухудшить или замедлить технологический процесс, уменьшить выход продукции. Поэтому выделение микроорганизмов в чистом виде производиться в стерильной посуде и на стерильных средах с соблюдением правил асептик, чтобы предотвратить попадание микроорганизмов из окружающей среды. Одним из основных правил асептики является тщательная стерилизация питательных сред, посуды, инструментов, воды и т.д. посуда, предназначенная для микробиологических работ должна быть чистой и не содержать веществ, которые задерживают рост и развитие микробов. Стеклянную посуду моют теплой водой с содой с помощью ершей и щеток, затем ополаскивают дистиллированной водой, высушивают, заворачивают в бумагу (чашки Петри, пипетки, инструменты) и стерилизуют сухим паром при 1650-1700С в течении 1 часа, а пробирки, колбы питательной средой закрытые ватными пробирками насыщенным паром под давление при 1атм. В течение 20-30 мин.

Стерилизацию производят физическим, химическим и биологическим методами.

Физический метод стерилизации осуществляется:

• - высокой температурой;
• - различными излучениями;
• - фильтрованием через бактериальные фильтры

Методы, основанные на термической обработке стерилизуемых объектов. Губительное действие высокой температуры обусловливается повреждением коллоидного состояния плазмы, денатурацией белка с последующей коагуляцией его, а также нарушением ферментных систем микроорганизмов.

Различают влажные и сухие способы тепловой стерилизации.

Влажные способы используются, главным образом, для стерилизации питательных сред. К таким способам относятся стерилизация паром под давлением, стерилизация текучим паром (дробная стерилизация) и тиндализация.

Стерилизация питательных сред насыщенным паром под давлением (автоклавирование). Стерилизация паром под давлением – самый эффективный в бактериологической практике способ стерилизации питательных сред и посуды, так как с его помощью быстро достигается полное и надежное обеспложивание. Этот способ стерилизации основан на том, что образующийся при кипячении воды пар не выходит наружу, а, скапливаясь в замкнутом пространстве, повышает давление. При создании избыточного давления возрастает температура кипения воды и температура пара. Стерилизацию паром под давлением осуществляют в паровых стерилизаторах, принцип работы и устройство которого описаны ниже.

Совместное действие высокой температуры и давления пара обеспечивает особую эффективность данного способа (таблица 1).

Таблица 1 – Температура насыщенного пара при разных давлениях

Давление нормальное, атм.	Температура, 0С	кПа
1,0	101,32	100
1,5	151,98	111
2,0	202,65	121
2,5	251,20	128
3,0	299,75	134

При этом погибают и вегетативные клетки, и споры микроорганизмов. Установлено, что споры большинства микроорганизмов не выдерживают и 5-минутную экспозицию в насыщенном паре при плюс 121 0С. Стерилизацию текучим паром под давлением осуществляют в автоклавах. Автоклав представляет собой металлический двустенный резервуар, способный выдерживать высокое давление, в который помещают стерилизуемый материал на специальную подставку. Предметы следует размещать не слишком плотно, так как пар должен проходить между ними, иначе они не нагреваются до нужной температуры и могут остаться нестерильными. По окончании времени стерилизации автоклав открывают, когда давление в нем сравняется с атмосферным. Преждевременное открывание крана автоклава недопустимо, так как перегретые среды при резком снижении давления сразу же бурно закипают, смачивают и даже иногда выталкивают ватные пробки, что нарушает впоследствии стерильность материала.

К работе с автоклавом допускаются только подготовленные лица (работник, прошедший курсы работы с аппаратами под давлением - автоклавер)!

Разновидностями стерилизации текучим паром являются: дробная стерилизация (тиндализация) и пастеризация.

Стерилизация текучим паром производится в кипятильнике Коха и автоклаве при открытом паровыпускном кране и не завинченной крышке по 30 мин. – 1 ч. в течение трех дней. Поэтому этот способ называют еще дробной стерилизацией или тиндализацией. Тиндализация – это дробная стерилизация при низкой температуре – плюс 56–58 0С, была предложена в 1877 г. Тиндалем. При этом погибают бесспоровые и вегетативные формы споровых микроорганизмов, а споры остаются жизнеспособными. Поэтому однократная стерилизация недостаточна, повторяют ее до трех. В промежутках между нагревами среды выдерживают в термостате при температуре плюс 20–300С, провоцируя прорастание спор в молодые вегетативные клетки, которые чувствительны к температуре и уничтожаются последующей тепловой обработкой. Недостатком стерилизации текучим паром является его продолжительность. Однако этим методом пользуется в микробиологической практике из-за его доступности. Кроме того, этот способ применяется для стерилизации субстратов, которые изменяют химический состав и свойства при температуре свыше плюс 100 0С. К ним относятся среды, содержащие углеводы (молоко, картофель, фруктовые соки, напитки, сусло и т.д.).

Однократный прогрев материала при температуре ниже плюс 100 0С известен под названием пастеризация. Этот метод, предложенный Пастером, предназначен для уничтожения только бесспоровых форм микроорганизмов. Следовательно, в подавляющем большинстве случаев он не обеспечивает стерильности. Пастеризацию проводят при плюс 60–80 0С 10–30 мин.

Пастеризации подвергают питательные среды, пищевые продукты, которые изменяются и теряют свою питательную ценность при более высокой температуре. Широко применяется пастеризация молоко, пива, фруктовых и ягодных соков и т.д. при этом сохраняются витамины, вкусовые качества пищевых продуктов, погибают вегетативные формы микроорганизмов и продлеваются сроки их хранения. После обработки пищевые продукты охлаждаются и хранят при низких температурах, однако длительному хранению продукты не подлежат.

Сухие способы. При работе в микробиологической лаборатории из сухих способов термической стерилизации используются следующие:

Прокаливание на огне (фламбирование) очень быстрый и надежный способ стерилизации бактериологических петель, препаровальных игл перед посевами. Этим способом можно стерилизовать также мелкие металлические предметы (пинцеты, скальпели) и предметные стекла. Осуществляют прокаливание над пламенем горелки.

Стерилизация сухим жаром (сухим нагретым воздухом) используется для стерилизации микробиологической посуды (пипеток, чашек Петри), песка. Осуществляют стерилизацию сухим жаром при температуре плюс 150–170 0С в течение 1–1,5 часов в печах Пастера или в сушильных шкафах.

Таблица 2 – Время, необходимое для стерилизации стеклянной посуды сухим жаром

Температура, 0С	Время экспозиции, мин
140	180
150	150
160	120
170	60

Методы холодной стерилизации

Механическая стерилизация (фильтрование). Этот способ применяется для стерилизации сред в тех случаях, когда их нельзя подвергать нагреванию. При механической стерилизации стерилизуемые жидкости фильтруют через специальные фильтровальные приборы, которые имеют настолько мелкие поры, что на своей поверхности задерживают взвешенные в жидкости частицы, в том числе и микробы. Для фильтрации в микробиологической практике применяют различные фильтровальные приборы (фильтры Зейтца, свечи Шамберлана, Мандлера, Беркефельда и др.).

Фильтр Зейтцасостоит из пластинчатых асбестовых кружочков различной величины, которые вставляются в металлические держатели. Фильтр с металлическим корпусом монтируется в колбу Бюнзена с боковым тубусом, через него выкачивают воздух с помощью насоса. Мелкие поры фильтра легко пропускает жидкость, но задерживают клетки бактерий, дрожжей и т.д., за исключением фильтрующихся форм – вирусов, бактериофагов. Предварительно всю установку стерилизуют в автоклаве.

Мембранные фильтры Мембранные фильтры – пористые нитроцеллюлозные пленки в форме кружочков (35 мм, 0,1 мм). По размеру пор различают фильтры: № 1, 2, 3, 4, 5 (самый плотный № 1). В бактериологических лабораториях фильтры применяют для исследования воды и имеет ряд преимуществ: позволяет производить прямой подсчет колоний, выделить микроб в чистой культуре, экономит среды и время. После фильтрации воды фильтр снимают стерильным пинцетом и раскладывают в чашках Петри на среду Эндо (по 4–5 штук). Посевы инкубируют в термостате при плюс 37 0С. На следующий день (через 24 часа) с помощью лупы просматривают фильтры. Отсутствие роста колоний на фильтре служит основанием отрицательного ответа. При наличии колоний делают мазки и красят по методу Грама. Из колоний с грамотрицательными бактериями делают посев на среду Эндо, делают пересчет на коли-титр и коли-индекс. Например, на фильтрате выросло 5 колоний, воды было пропущено 500 мл. Следовательно, одна кишечная палочка находилась в 100 мл воды и коли-титр равен 100, а коли-индекс равен 10.

Рисунок 1 – Виды фильтров: 1 – воронка Бюхнера; 2 – фильтры; 3 – колба Эрленмейера с фильтром; 4 – асбестовые фильтры

Химический метод стерилизации

Химическая стерилизация. Основан на применении антисептиков. Антисептиками называют химические вещества, применяемые для уничтожения микроорганизмов. Этот вид стерилизации в практике приготовления питательных сред имеет ограниченное применение. Антисептики применяются для обработки различных биопрепаратов-сывороток, вакцин и другие (хлороформ, хинозол, толуол, эфир, борная кислота, формалин), для предупреждения бактериального загрязнения питательных сред. Для освобождения от консерванта среду нагревают на водяной бане при плюс 56 0С.

Для дезинфекции лабораторий, производственных и складских помещений, оборудования и т.д. применяют хлорную известь, хлорамин, формалин, фенол и другие. Химическая стерилизация используется также для дезинфекции оборудования, помещений, использованной посуды и отработанного микробиологического материала. В качестве антисептиков в пищевой промышленности применяются борная, бензойная, салициловая кислоты, глицерин, хлорная известь (для воды). Химические вещества, применяемые для уничтожения патогенных микроорганизмов во внешней среде, называют дезинфицирующими, а процесс дезинфекцией (рабочее место, лаборатория, рабочая одежда, складские помещения и т.д.). Иначе, дезинфекция – это уничтожение микроорганизмов в окружающей среде. Дезинфицирующие вещества можно разделить на следующие группы:

• растворы кислот, щелочей и их соли;
• хлорсодержащие вещества;
• соединения тяжелых металлов;
• фенол и его производные;
• газообразные вещества.

Ниже производятся основные дезинфицирующие средства, которые применяются в микробиологической лаборатории в качестве антисептиков.

1. Растворы кислот, щелочей и их соли:

1.1 Каустическая сода. В 0,1 %-ном растворе каустической соды (NaOH) с рН–10 микроорганизмы погибают в течение 1–2 мин. При температуре плюс 40 С.

1.2 Кальцированная сода. 1 %-ный раствор кальцированной соды (CaCO3) оказывает бактерицидное действие на микроорганизмы при температуре плюс 40 С.

2. Хлорсодержащие вещества:

2.1 Хлор. Хлор является ядовитым веществом, действует губительно на микроорганизмы в малых концентрациях.

2.2 Хлорная известь. (Белый комковатый порошок с резким запахом хлора). Дезинфицирующая активность хлорной извести широко применяется в микробиологической практике. Даже слабые концентрации хлорной извести оказывают бактерицидное действие. Эффективность действия хлорной извести зависит от содержания в ней активного хлора (обычно его 35–36 ). Хлорную известь применяют обычно в виде 2 -ного раствора.

2.3 Хлорамин – белое кристаллическое вещество, содержащее 26–26,5  активного хлора, хорошо растворяется в воде. В микробиологической лаборатории используются 0,2–10  раствор хлорамина.

3. Бактерицидное действие оказывают соли тяжелых металлов – ртути, серебра, меди. Они вызывают коагуляцию белков микроорганизмов.

3.1 Сулема (двухлористая ртуть). Сулема является сильным ядом, применяется для общей дезинфекции в виде раствора. Бактерицидное действие на вегетативные клетки микроорганизмов проявляется при концентрации 1:1000, а на споры бактерий при разведении 1:500 в течение 1–30 м.

4. Фенолы и их производные. К этой группе относятся многие производные фенола. Из них в микробиологической практике применяется карболовая кислота (фенол в растворе) и лизол. Они легко вступают в соединения с белком, денатурируют, нарушая жизненно важные функции или оказывают частично литическое (растворяющее) действие.

4.1 Карболовая кислота – бесцветное кристаллическое вещество с резким своеобразным запахом, обладает большой гигроскопичностью, поэтому при приготовлении рабочих растворов учитывают наличие воды в исходном веществе. В микробиологической практике применяют 3–5  растворы карболовой кислоты.

5. Газообразные вещества. Сильным бактерицидным действием обладают многие газы: формальдегид, окись этилена, сернистый ангидрид, В-пропилактион.

5.1. Формалин – это водный раствор газа формальдегида. Это вещество оказывает действие на белки микроорганизмов и приводит денатурации. Для дезинфекции формалин применяют 2 -ного раствора.

Биологический метод стерилизации основан на применении антибиотиков.

Антибиотиками называют специфические вещества, обладающие антимикробными действиями и выделяемые микробами-антагонистами в процессе их жизнедеятельности. Антибиотики образуются растительным и животным организмами, но в основном продуцируются микроорганизмами. В отличие от физического и химического метода стерилизации, антибиотики обладают избирательностью действия, т.е. действуют губительно на определенные виды микроорганизмов.

Стерилизация ультрафиолетовыми лучами. Этот способ стерилизации используется для стерилизации воздуха в микробиологическом боксе и в лаборатории перед проведением микробиологических исследований. Стерилизацию ультрафиолетовыми лучами проводят с помощью бактерицидных ламп. Они могут быть использованы для уничтожения инфекции из вне, разливе минеральных вод, напитков, фасовке и упаковке пищевых продуктов, лечебных препаратов, для обеззараживания воды, идущей для промывки производственных дрожжей, а также питьевой воды, тары, оборудования, посуды. Ультрафиолетовые лучи действует губительно не только на вегетативные клетки, но и споры микроорганизмов. Однако ультрафиолетовые лучи обладают низкой проникающей способностью, поэтому их действие проявляется только на поверхности облучаемых продуктов. Но их применение в сочетании с охлаждением удлиняет сроки хранения мяса и мясопродуктов 2–3 раза.

Устройство парового стерилизатора и принцип его работы. Устройство стерилизатора

Основными частями стерилизатора являются: стерилизационная камера – служит для размещения стерилизуемых объектов; парогенератор – служит для выработки пара (в парогенераторе находятся нагревательные элементы - тэны, используемые для нагрева воды и получения пара, и датчики уровня, которые нужны для предотвращения выхода из строя нагревательных элементов); система трубопроводов – для соединения сборочных единиц стерилизатора; электрошкаф – для управления электрической системой стерилизатора; манометр электроконтактный – для наблюдения за давлением в парогенераторе и поддержания его работы в автоматическом режиме; моновакуумметр – для наблюдения за давлением и разряжением в стерилизационной камере; клапан предохранительный – для сброса пара при превышении давления в парогенераторе; колонка водоуказательная (водомерная трубка) – для наблюдения за уровнем жидкости в парогенераторе; вентили – для управления работой стерилизатора.

Принцип действия пневмогидравлической и электрической систем парового стерилизатора Заключается в следующем:

Вода поступает по водопроводу в парогенератор. Контроль за уровнем жидкости в парогенераторе осуществляют с помощью водомерной трубки. После включения стерилизатора, начинают нагреваться тэны, благодаря чему вода нагревается до рабочей температуры. В результате образуется пар. При достижении в парогенераторе давления пара 0,11 МПа открывается вентиль «Пар в камеру» и вентиль «Слив конденсата». Происходит продувка и прогрев стерилизационной камеры, после чего вентиль «Слив конденсата» закрывается. При достижении в стерилизационной камере рабочего давления (контролируется электроконтактным манометром) происходит отчет времени стерилизации. В процессе стерилизации происходит автоматическое включение и отключение стерилизатора с помощью электроконтактного манометра. Контроль за давлением в стерилизационной камере осуществляется моновакуумметром. После проведения стерилизации аппарат отключают от сети и перекрывают вентиль «Пар в камеру». Далее, по мере падения давления в стерилизационной камере до 0,06 МПа (контроль осуществляется по моновакуумметру) открывается вентиль «Вакуум». В стерилизационной камере создается разряжение. Происходит процесс сушки стерилизуемого материала. По истечении сушки открывается вентиль «Воздух в камеру». При этом происходит выравнивание давления в стерилизационной камере с атмосферным давлением.

Порядок выполнения работы

Студенты знакомятся с принципами составления и классификацией питательных сред, методами стерилизации питательных сред, посуды, инвентаря, изучают устройство парового стерилизатора и принцип его работы и кратко конспектируют изложенный в теоретической части материал. Затем готовят посуду, питательные среды и ватно-марлевые пробки для проведения микробиологического анализа.

Приготовление посуды для проведения микробиологического анализа

Для проведения микробиологического анализа используют чашки Петри, которые герметично упаковываются в пергаментную бумагу и стерилизуются. Пипетки на 1 см3 закрывают ватными тампонами и также заворачивают в бумагу. Колбы закрывают ватно-марлевыми пробками и сверху делают колпачки из пергаментной бумаги.

Стерилизация посуды осуществляется в автоклаве при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 30–40 минут или сухим жаром в сушильном шкафу или печи Пастера при 165–170 С в течение 1–1,5 часа.

Стерильную посуду следует хранить в плотно закрывающихся шкафах или ящиках с крышками в течение не более 30 суток.

Приготовление питательных сред из промышленно выпускаемых сухих сред

Заключается в растворении определенного количества порошка в воде, доведении полученной смеси до кипения и кипячении в течение 5 минут. Далее (при необходимости) среда фильтруется через ватно-марлевый фильтр и разливается в пробирки или колбы, которые закрываются ватно-марлевыми пробками. Далее среды стерилизуют в автоклаве. С использованием сухих сред готовят мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), среду Сабуро, среду Кесслера, среду для определения мезофильный аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (среда для определения КМАФАнМ), среду Эндо и др.

Приготовление питательных сред из отдельных компонентов. Особенности культивирования микроорганизмов

Цель: изучить правила работы в микробиологической лаборатории, особенности культивирования микроорганизмов, способы приготовления питательных сред и методы их стерилизации.

Задачи: ознакомится с правилами поведения при выполнении микробиологического практикума. Изучить особенности культивирования микроорганизмов, методы приготовления и разлива питательных сред, методы стерилизации посуды и питательных сред.

Материалы и оборудование. Стерильные чашки Петри, стерильные конические колбы на 100–150 мл, агар питательный, пептон, сено, клубни картофеля, мел, плитка, спиртовки, колбы, вата, марля, пипетки, весы, разновесы, термостат.

Основные понятия. Культивирование, культура, поверхностное культивирование, глубинное культивирование, периодическое культивирование, непрерывное культивирование, чистая культура, накопительная культура, посев, инкубация, пассирование, элективные среды, накопительные среды, оптимальные среды, естественные среды, синтетические среды, полусинтетические среды, агар, стерилизация, фламбирование, тиндализация, пастеризация, автоклавирование, МПА.

Ход работы:

Задание 1. Изучить правила работы при выполнении микробиологического практикума.

Задание 2. Изучить классификацию питательных сред, особенности их приготовления и разлива, методы стерилизации питательных сред и посуды.

Задание 3. Приготовить и разлить питательную среду МПА в стерильные чашки Петри.

Задание 4. Получить накопительную культуру сенной палочки (Bacillus subtilis).

Сено мелко нарезают и помещают в колбу объемом 500 мл, заполняя ее на одну четверть объема, добавляют щепотку мела и кипятят 15-20 мин, пока среда не приобретет цвет настоя крепкого чая. Сенной отвар разливают в стерильные конические колбы на 100–150 мл слоем 1,0–1,5 см, закрывают ватными пробками и помещают в термостат при температуре 22–25 °С.

Через двое суток на поверхности среды развивается беловатая пленка Вас. subtilis, которая при старении, на 3–4-е сутки, становится серовато-зеленоватой. Другие микроорганизмы при этом вырастают редко и в небольших количествах.

Задание 5. Получить накопительную культуру картофельной палочки (Вас. subtilis var. mesentericus).

Промытые клубни картофеля, не очищая, нарезают кружочками. Поверхность их натирают мелом для нейтрализации среды и помещают в стерильные чашки Петри на двойной слой фильтровальной бумаги, смоченный дистиллированной водой. Чашки с картофельной средой выдерживают в автоклаве при 0,5 атм. в течение 10 мин и ставят в термостат с температурой плюс 27–30 С на 3–4 суток.

На поверхности ломтиков картофеля образуется плотная морщинистая пленка культуры картофельной палочки. Окраска пленки может быть разной: беловато-серой, розоватой, желто-бурой, черной, что зависит от разновидностей культуры, получивших преимущественное развитие.

Изучить основные этапы развития науки микробиологии, вклад русских и зарубежных ученых в ее развитие. Заполнить таблицу № 3.

Таблица 3 – История развития микробиологии

Дата	Ученый, название трудов	Направление исследования
	А. ван Левенгук, Л. Пастер, Р. Кох, Л. С. Ценковский, И. И. Мечников, Н. Ф. Гамалея, Э. Дженнер, М. Бейеринк, С. Н. Виноградский, Д. И. Ивановский, Г. Н. Минх, В. Л. Омелянский, А. Клюйвер, К.ван Ниль и др.

Контрольные вопросы

1. Что такое питательные среды?

2. Микроорганизмы, которые встречаются в пищевых продуктах, являются хемоорганогетеротрофами. Что это значит?

3. Охарактеризуйте пищевые потребности хемооргано-гетеротрофов.

4. Какие требования предъявляются к питательным средам?

5. Каким образом готовятся плотные питательные среды и для чего они используются?

6. Почему в качестве уплотнителя для питательных сред лучше использовать агар-агар, а не желатин?

7. На какие группы делятся питательные среды по происхождению и составу?

8. Что такое синтетические среды и в каких случаях они применяются?

9. Для каких целей используются универсальные, избирательные и дифференциально-диагностические среды?

10. Приведите примеры универсальных, избирательных и дифференциально-диагностических питательных сред.

11. Что такое стерилизация? Какие методы стерилизации Вам известны?

12. Что такое стерилизация? Какие методы стерилизации Вам известны?

13. Какими из известных Вам способов можно стерилизовать питательные среды?

14. Как готовятся питательные среды и посуда для стерилизации?

15. Каково устройство и принцип работы парового стерилизатора?