1. Красители
Фуксин основной спиртовой раствор – насыщенный
Фуксин основной кристаллический – 10 г/p>
Этиловый спирт, 96% – 100 мл
Фуксин растворяют в 100 мл 96 %-ного этанола. Раствор может храниться долгое время в бутылке из темного стекла с притертой пробкой.
Фуксин основной карболовый – фуксин Циля
Фуксин основной кристаллический – 1 г
Карболовая кислота (фенол) – 5 г
Этиловый спирт, 96% – 10 мл
Дистиллированная вода – 100 мл
При приготовлении раствора предварительно взвешивают определенное количество (1 г) фуксина основного кристаллического, вносят в фарфоровую ступку и растирают с определенным количеством (5 г) карболовой кислоты, добавляя спирт небольшими порциями и дистиллированную воду до полного растворения кристаллов, после чего приливают оставшуюся воду. Приготовленный краситель ставят в термостат при 37 С на двое суток. Затем отфильтровывают через складчатый бумажный фильтр.
Фуксин основной карболовый устойчив и может храниться долго. Хранить следует в бутылке из темного стекла с притертой пробкой.
Фуксин основной карболовый можно приготовить другим способом:
Вначале готовят два раствора.
1-й раствор
Фуксин основной кристаллический – 1 г
Этиловый спирт, 96% – 10 мл
Смесь растирают в фарфоровой ступке до полного растворения кристаллов фуксина.
2-й раствор
Карболовая кислота – 5 г
Дистиллированная вода – 95 мл
Воду подогревают до 50 С для лучшего растворения карболовой кислоты. Второй раствор вливают в первый, хорошо взбалтывают и фильтруют через складчатый бумажный фильтр.
Фуксин основной, водный (фуксин Пфейффера)
Карболовый фуксин Циля – 10 мл
Дистиллированная вода – 90 мл
Водный фуксин нестоек, его лучше готовить непосредственно перед употреблением. Раствор водного фуксина может храниться не более 10 дней.
Карболовый генциановый фиолетовый
Генциановый фиолетовый (кристаллы) – 1 г
Этиловый спирт, 96 – 10 мл
Карболовая кислота – 5 г
Дистиллированная вода – 100 мл
Техника приготовления карболового генцианового фиолетового такая же, как карболового фуксина Циля.
При приготовлении карболового генцианового фиолетового можно также готовить предварительно два раствора.
1-й раствор
Генциановый фиолетовый – 1 г
Этиловый спирт, 96% – 10 мл
2-й раствор
Карболовая кислота – 5 г
Дистиллированная вода – 95 мл
Последовательность и способ приготовления первого и второго растворов такие же, как и при приготовлении карболового фуксина Циля.
Приготовление красящих бумажек генцианвиолета (по Синеву)
Для приготовления бумажек фильтровальную бумагу предварительно испытывают на пригодность. Для этого полоску фильтровальной бумаги погружают в спиртовой раствор красителя (карболового генцианового фиолетового), высушивают на воздухе. Хорошая бумага окрашивается равномерно без пятен. Если небольшой кусок такой бумаги положить на стекло с несколькими каплями воды, он сразу же пропитается водой и краситель через несколько секунд перейдет в раствор. Бумагу для пропитывания нарезают полосками (шириной 2,5-3 см, длиной 30 см) и погружают в краситель так, чтобы смачивались обе поверхности. Затем полоски вынимают, высушивают на воздухе при комнатной температуре или в термостате при 37 С.
Пропитывать красящиеся бумажки можно также спиртовым раствором генцианвиолета следующего состава:
Генциановый фиолетовый (кристаллы) – 1 г
Спирт этиловый, 96% – 100 мл
Глицерин – 5 мл
Метиленовый синий (насыщенный спиртовой раствор)/p>
3 г метиленового синего растворяют в 100 мл 96%-ного этанола. Раствор выдерживают 2-3 дня, периодически взбалтывая. Затем фильтруют через бумажный фильтр. Раствор устойчив.
Раствор бриллиантовой зелени (раствор малахитового зеленого)
Водный насыщенный раствор готовится путем растворения 10 г малахитового зеленого в 10 мл дистиллированной воды. Спиртово-водный раствор: 10 г малахитового зеленого смешивается с 80 мл дистиллированной воды и 20 мл 96 %-ного этанола.
Метиленовый синий 1:40
1 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего смешивают с 40 мл дистиллированной воды.
Метиленовый синий, щелочной раствор (по Леффлеру)
К 100 мл дистиллированной воды прибавляют 30 мл насыщенного спиртового раствора мителенового синего и 1 мл 1 %-ного водного раствора гидроксида калия.
Сафранин (водный)
10 мл 2,5 %-ного раствора сафранина в 96%-ном этаноле смешивается со 100 мл дистиллированной воды.
Раствор Люголя (в модификации Грама)
В ступку вместимостью 30–50 мл помещают 1 г кристаллического йода и 2 г йодида калия, растирают смесь пестиком, добавляют 1 мл дистиллированной воды, продолжают растирать кристаллы и добавляют еще 5 мл воды. При этом йод растворяется в йодиде калия. Раствор количественно переносят в склянку и доводят общий объем до 300 мл. Раствор годен не более 30 дней, хранят его в прохладном месте, в темноте, лучше в посуде оранжевого цвета.
Раствор Люголя для выявления гликогена и гранулезы
Кристаллический йод – 1 г
Йодид калия – 3 г
Вода дистиллированная – 300 мл
Раствор готовят так же, как и предыдущий.
Для обнаружения гликогена можно также использовать крепкий раствор йода
Кристаллический йод – 7 г
Йодид калия – 20 г
Йодид калия – 20 г
Краска Муромцева
Готовят два раствора:
1-й раствор
Фуксин основной – 0,15 г
Спирт, 96% – 20 мл
Кристаллическая карболовая кислота – 10 г
2-й раствор
Метиленовый синий – 2,5 г
Дистиллированная вода – 200 мл
Оба раствора смешивают и фильтруют через бумажный фильтр.
2. Питательные среды Универсальные питательные среды
Мясопептонный бульон. Приготавливают мясную воду: 1 кг говяжьего мяса, освобожденного от костей, жира, сухожилий, пропускают через мясорубку, заливают 2 л водопроводной воды. Фарш настаивают в воде 12–24 часа на холоде. За это время из мяса экстрагируются водорастворимые белки, аминокислоты, витамины, углеводы, минеральные и другие вещества. Настой фильтруют через двойной слой марли, мясо хорошо отжимают и фильтрат кипятят 30 мин для свертывания белков. Сняв жир, остывшую жидкость пропускают через ватно-марлевый фильтр и доливают водой до первоначального объема. Мясную воду разливают по колбам или бутылкам и стерилизуют в автоклаве при 0,1 МПа в течение 20 мин.
Для приготовления мясопептонного бульона к мясной воде добавляют 1 % пептона и 0,5 % химически чистого хлорида натрия, кипятят 10 мин, фильтруют через складчатый бумажный фильтр, устанавливают рН 7,2–7,4 10 % раствором двууглекислой соды и снова кипятят 10 мин. Мясопептонный бульон должен иметь соломенный цвет и быть совершенно прозрачным. Его разливают в пробирки, колбы, закрывают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют при давлении 0,1 МПа 20-30 мин.
Питательный бульон можно приготовить из заменителей мяса (мясного экстракта, рыбного гидролизата) по способу, указанному на этикетке.
Мясопептонный агар готовится из мясопептонного бульона с добавлением 2–3 % измельченного или порошкообразного агар-агара. Раствор нагревают до кипения и кипятят до полного растворения агара. Затем раствор охлаждают до 50 С и осветляют взбитым куриным белком (1 белок на 1 л среды), смешанным с 30 мл воды, вновь доводят до кипения и кипятят 20 мин. Белок свертывается, оседает и осветляет среду. Горячий агар фильтруют через ватно-марлевый слой, доводят до рН 7,2–7,4, разливают по пробиркам или колбам и стерилизуют 20 мин при давлении 0,1 МПа.
Пептонная вода. Растворяют 30 г пептона в 1 л дистиллированной воды и стерилизуют 20 мин при давлении 0,1МПа.
Пептонную воду можно также приготовить следующим образом: к 1 л дистиллированной воды добавляют при нагревании 10 г пептона, 5 г хлорида натрия и 0,1 г нитрата калия. Фильтруют через бумажный фильтр и устанавливают рН 7,6–7,8. Разливают по пробиркам и стерилизуют текучим паром дробно по 30 мин в течение 3 суток.
Солодовое сусло. 250-300 г ячменного сухого солода крупного помола заливают 1 л водопроводной воды, нагревают до 48–50 С и, непрерывно помешивая во избежание образования комочков, поддерживают температуру в течение 30 мин. Затем температуру повышают до 55–58 С, через 30 мин до 63 С и на этом уровне выдерживают смесь до полного осахаривания крахмала. Готовую среду отжимают через полотняный фильтр, чтобы удалить дробину, затем фильтруют через складчатый бумажный фильтр. В фильтрате определяют концентрацию сухих веществ (СВ) при 20 0С, которая обычно составляет 18–20 %. До нужной концентрации фильтрат разводят водопроводной водой. Для выращивания дрожжей солодовое сусло должно иметь концентрацию 6–8 % СВ, для молочнокислых бактерий – 8–12 % СВ, для мицелиальных грибов 3–4%, рН среды 5,6–6,0. При более низком значении рН сусло подщелачивают 10 % раствором двууглекислой соды или гидроксида натрия. Далее сусло разливают в колбы или пробирки, закрывают их ватно-марлевыми пробками и стерилизуют при давлении 0,05 МПа 30 мин.
Для приготовления данной среды можно также использовать неохмеленное заводское пивное сусло, доведенное до определенного содержания СВ и рН.
Сусло-агар. При приготовлении сусло-агара к солодовому суслу добавляют 2 % агара. Для микроорганизмов, образующих кислоты добавляют также немного мела. Среду стерилизуют 30 мин при давлении 0,05 МПа или дробно текучим паром.
Среда используется для выделения, выращивания и хранения дрожжей, мицелиальных грибов, молочнокислых и уксуснокислых бактерий.
Специальные (элективные) питательные среды Среды для выявления стафилококков
Молочно-солевой агар: в 100 см3 питательного агара растворяют при кипячении 6,5 г хлорида натрия, стерилизуют при 0,1 МПа в течение 20 мин. К расплавленному и остуженному до 45 °С агару добавляют 10 см3 на 100 см3 обезжиренного стерилизованного молока, тщательно размешивают и разливают тонким слоем в чашки Петри. Учитывают колонии с зоной просветления.
Желточно-солевой агар: к 150 см3 расплавленного и охлажденного до 45 С 6 %-ного солевого агара стерильно добавляют 50 см3 желточного раствора (1 желток куриного яйца растворяют в 150–200 см3 физиологического раствора). Быстро перемешивают и разливают в чашки Петри.
Среды для культивирования дрожжей и микроскопических грибов
Среда Сабуро. Основой этой среды является дрожжевая вода. Для приготовления дрожжевой воды 70–100 г свежих прессованных дрожжей (7–10 г сухих дрожжей) кипятят в течение 20–30 мин в 1 л дистиллированной воды и отстаивают в высоком цилиндре на холоде 12 час. Отстоявшуюся жидкость декантируют, добавляют еще 1 л воды, кипятят 30 мин, фильтруют, доводят рН до требуемого значения. Приготовленную среду стерилизуют дробно по 20 мин 2–3 суток. К 100 мл стерильной дрожжевой воды добавляют 1 % пептона, 2 % агара, после растворения агара вносят 4 % глюкозы или мальтозы, фильтруют, разливают в пробирки и стерилизуют при 0,05 МПа в течение 20 мин.
Среду можно готовить и на обычной 1 %-ной пептонной воде.
Синтетическая среда Ридер для дрожжей. В состав среды входят (в г/л): сульфат аммония 3, сульфат магния 0,7, нитрат кальция 0,04, хлорид натрия 0,5. дегидрофосфат калия 1,0, гидрофосфат калия. Начальное значение рН среды 6,6. Для изучения размножения дрожжей добавляют 2 % сахара, для исследования брожения 5–10 %. Полная синтетическая среда содержит также витамины (в мкг/мл): инозит 5, биотин 0,0001, пантотеновую кислоту 0,25, тиамин 1,0, пиридоксин 0,25, никотиновую кислоту 0,5. Стерилизуют среду в автоклаве при давлении 0,1 МПа.
Картофельно-глюкозный агар. Очищенный и нарезанный ломтиками картофель массой 200 г заливают 1 л дистиллированной воды и кипятят в течение 1 часа. Отвар фильтруют, к фильтрату добавляют воду до первоначального объема, 2% глюкозы и 2-3% агар-агара. Среду разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при 0,1 МПа в течение 10 мин. При употреблении устанавливают рН 3,5 при помощи 10 %-ного стерильного раствора безводной лимонной кислоты.
Синтетическая среда Чапека для грибов. Состав среды (в г/л): сахароза или глюкоза 30, дигидрофосфат калия 1,0, нитрат натрия 2,0, сульфат магния 0,5, хлорид калия 0,05, сульфат железа 0,1, агар 20. Навеску агара выщелачивают и добавляют к указанным ингредиентам, предварительно растворенным в 1 л дистиллированной воды, прогревают текучим паром, устанавливают рН 4,0-5,5 10 % раствором лимонной кислоты или гидроксида натрия. Фильтруют, разливают в пробирки и стерилизуют дробно текучим паром 3 суток по 30 мин.
Среда с ацетатом для обнаружения несовершенных дрожжей. На 1 л водопроводной воды берут 10 г ацетата натрия, 10 г хлорида аммония, 5 г глюкозы, 3 мл дрожжевого автолизата, разливают в пробирки и стерилизуют при давлении 0,05 МПа в течение 30 мин.
Среды для культивирования молочнокислых бактерий
Цельное молоко разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при 0,1 МПа в течение 10 мин. Среду используют для изучения физиологических свойств молочнокислых бактерий.
Обезжиренное молоко отделяют от сливок путем сепарирования, разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при тех же режимах, что и цельное молоко. Среду используют для изучения физиологических свойств микробов и для группового количественного учета молочнокислых бактерий.
Гидролизованное молоко. В стерильном обезжиренном молоке устанавливают рН 7,6–7,8. Молоко нагревают до 45 0С и к 1 л молока добавляют 0,5–1 г панкреатина, предварительно растворенный в теплой воде, и 5 мл хлороформа. Емкость с молоком плотно закрывают корковой пробкой, смесь тщательно перемешивают и ставят в термостат при температуре 40 С на 18–24 часа. Затем полученную прозрачную жидкость декантируют и фильтруют через бумажный фильтр. Фильтрат разводят водой в 2 раза, устанавливают рН 7,0–7,2 и стерилизуют при 0,1 МПа в течение 15 мин.
Агар с гидролизованным молоком. В гидролизованное молоко вносят 1,5-2,0 % агар-агара. Смесь нагревают до кипения и выдерживают до полного растворения агара. Горячую среду фильтруют через ватный фильтр, разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при давлении 0,1 МПа в течение 10–15 мин.
Среда для количественного учета гнилостных бактерий
Молочный агар готовят путем внесения 20 % горячего стерильного обезжиренного молока в стерильный расплавленный 2 % водный раствор агар-агара. Используется эта среда для количественного учета протеолитических и пептонизирующих бактерий (микрококков, маммококков). Вокруг колоний гнилостных бактерий образуются зоны протеолиза и пептонизации.
Среда с говяжьим жиром. В состав среды входят: пептон – 1 г, дрожжевой автолизат – 0,3, двузамещенный фосфат натрия – 0,1 г, агар – 1,5 г, дистиллированная вода – до 100 мл, рН 7,0-7.4.
Отдельно готовят в пробирках стерильный говяжий жир. Среду стерилизуют при 121 С (0,1 МПа) в течение 15 мин.
Среды для выявления и идентификации бактерий группы кишечной палочки
Среда Кесслер: к 1 л водопроводной воды добавляют 10 г пептона и 50 мл свежей бычьей желчи. Смесь кипятят на водяной бане 30 мин, помешивая, после чего фильтруют через вату, добавляют 2,5 г глюкозы и доводят объем до 1 л. Устанавливают реакцию среды (рН 7,4–7,6) и добавляют 2 мл 1 %-ного водного раствора кристаллического фиолетового. Среду разливают в пробирки или колбы с поплавками в количествах, предусмотренных для контроля отдельных продуктов. Стерилизуют при 0,05 МПа в течение 20 мин. Цвет среды должен быть темно-фиолетовым.
Лактозо-пептонная (глюкозо-пептонная) среда. 10 г пептона, 5 г натрия хлористого, 5 г лактозы (глюкозы) растворяют при нагревании в 1 л дистиллированной воды. После растворения ингредиентов устанавливают рН 7,4–7,6. Среду разливают по пробиркам и стерилизуют при 0,05 МПа 10–5 мин.
Полужидкая среда с лактозой или маннитом (глюкозой). В 1 л дистиллированной воды растворяют 10 г пептона, 5 г натрия хлористого, 4–5 г агар-агара, доводят до кипения, устанавливают рН 7,2-7,4, добавляют 1 мл 1,6 % спиртового раствора бромтимолового синего. Стерилизуют при давлении 0,1 МПа 20 мин. В расплавленную среду вносят 5 г лактозы или маннита (глюкозы), нагревают до кипения, разливают в стерильные пробирки на высоту 3–5 см и стерилизуют при 0,05МПа 10-15 мин. Правильно приготовленная среда – зеленого цвета с синеватым оттенком (цвет бутылочного стекла). Срок хранения такой среды не более 2-х недель.
Среда Эндо (фуксин-сульфитный агар): в 5 мл стерильной воды растворяют 1 г лактозы, подогревают на водяной бане при 100 С в течение 5 мин, соблюдая стерильность, прибавляют к 100 мл расплавленного 2 %-ного мясопептонного агара с рН 7,6–7,8. В отдельную стерильную пробирку вносят 0,5 мл приготовленного накануне и профильтрованного 10 %-ного раствора основного фуксина, к которому добавляют свежеприготовленный 10%-ный раствор сульфита натрия до получения бледно-розового окрашивания. Полученную смесь вносят в расплавленный лактозный агар, тщательно перемешивают, избегают вспенивания, и разливают в стерильные чашки Петри. Среда Эндо должна быть свежеприготовленной.
Среда Китта-Тароцци. Проваренные и промытые водой кусочки печени или мяса опускают в пробирки и заливают мясопептонным бульоном с 1% глюкозы на ½ объема пробирки. Сверху приливают слой вазелинового масла высотой 1 см. Стерилизуют среду при 0,1 МПа в течение 15 мин.