Көптеген жетістіктерге қарамастан, клондау әдеттегі зертханалық әдіске айналды деп айтуға болмайды. Әлі де бұл көп жағдайда күтілетін нәтижелерге әкелмейтін өте күрделі процедура болып табылады. Жануарларды клондау кезінде қандай қиындықтар туындайды?

Ең алдымен, бұл – клондаудың төмен тиімділігі. Сүтқоректілерді клондау кезінде қолданылатын процедуралар жасушалар үшін өте ауыр болып келеді. Барлық жасушалар оларды аман-есен жеңе алмайды. Дами бастаған эмбриондардың барлығы туылғанға дейін өмір сүре бермейді. Сонымен, Долли қойын алу үшін, аналық жұмыртқасын шығару үшін, 40 қойға ота жасалды. 430 аналық жасушасының ішінен 277 диплоидты «зиготалар» пайда болды, олардың тек 29-ы дами бастады және «суррогат» аналарға имплантацияланды. Олардың ішінде бір ғана эмбрион туылғанға дейін аман қалды, бұл – Доллидің эмбрионы. Прометей клондалған жылқысын алу үшін шамамен 840 эмбрион «құрастырылған», олардың тек 17-сі «аналарға» имплантациялауға дейін дамыған. Олардың төртеуі ғана дами бастады, бірақ туылғанға дейін бір ғана Прометей жетті.

Тағы бір маңызды мәселе туылған клондардың денсаулығы болып саналады. Әдетте, келесі клонның тууы туралы хабарланған кезде оның керемет денсаулығы баса айтылады. Шынында да, туылған кезде өте сау болатын көптеген клондалған жануарлар ересек организмге дейін өмір сүрді және дені сау ұрпақтарын дүниеге әкелді. Алайда, содан кейін олардың организмінде әртүрлі органдар жүйелерінің функцияларының бұзылуы басталды. Сонымен, Долли сау болып туылды және бірнеше сау қозылар туды, бірақ содан кейін ол тез қартая бастады, сондықтан қарапайым қойдың тіршілік ұзақтығына қарағанда екі есе аз уақыт өмір сүрді. Рослин институтында клондалған трансгенді Полли мен Молли одан да аз өмір сүрді. Клондалған дала мысықтары сәтті өніп-өсе бастады. Дегенмен олардың өмір сүру ұзақтығы туралы әлі ешқандай мәліметтер жоқ. Бірақ туылған кезде дені сау болған Гаур өгізшесі ішек ауруы есебінен екі күн ғана өмір сүрді. Клондардың денсаулығы туралы мәселе әлі шешілген деп санауға болмайды, себебі әр түрлі зерттеушілердің нәтижелері бір-біріне қарама-қайшы болды. Кейбір мәліметтерге сәйкес көптеген клондар әлсіз иммунитетке ие, суық тиюге және асқазан-ішек ауруларына бейім және генетикалық ата-аналарына қарағанда 2–3 есе тез қартаяды. Жапон ғалымдарының зерттеулері клондалған тышқандар гендерінің шамамен 4 %-ында функциясы бұзылғанын көрсетті.

Жануарлар вегетативті түрде көбейе алмайтындықтан, клон алу үшін негізінен үш әдісті қолдануға болады:

- ұрықтанбаған аналық жыныс жасушасындағы хромосомалар жиынтығын екі есе көбейтіп, осылайша диплоидты аналық жыныс жасушасын алып, оны ұрықтандырусыз жетілдіру;

- дами бастаған эмбрионды бөлу арқылы монозиготалы егіздерді жасанды түрде алу;

- ядроны соматикалық жасушаның диплоидты ядросымен алмастыру арқылы аналық жыныс жасушасынан алып тастау және осындай «зиготаны» жетілдіру.

Осы үш мүмкіндіктің барлығын ғалымдар жануарларды клондау үшін пайдаланды.

Бірінші әдіс барлық жануарларға қолданылмайды. ХХ ғасырдың 30-жылдарында Б. Л. Астауров термиялық әсердің көмегімен тұт ағашының жібек құртының ұрықтанбаған аналық жыныс жасушасын әрі қарай дамуға белсендірді, сонымен бірге мейоздың бірінші бөлінуінің өтуіне тосқауыл қойды. Сондай-ақ, ядро диплоидты болып қалды. Мұндай диплоидты аналық жыныс жасушасының дамуы ананың генотипін дәл қайталайтын дернәсілдердің жарып шығуымен аяқталды. Әрине, тек аналықтар ғана алынды. Өкінішке орай, аналықтарды өсіру экономикалық тұрғыдан тиімсіз, өйткені азық-түліктің көп шығынымен олар сапасыз пілләлар (кокондар) береді. В. А. Струнников тек аталықтардан тұратын тұт ағашының жібек құртының клондарын алу әдісін жасап, бұл әдісті одан әрі жетілдірді. Ол үшін аналық жыныс жасушасының ядросына гамма-сәулелер мен жоғары температураның әсерін тигізді. Бұл ұрықтандыруға қабілетсіз ядроларды жасады. Мұндай аналық жыныс жасушасына енген сперматозоидтың ядросы екі еселеніп, бөлінуге кірісті. Бұл аталықтың генотипін қайталайтын аталық дарақтың дамуына әкелді. Алайда, өнеркәсіптік жібек шаруашылығы үшін алынған клондар жарамсыз болды, бірақ олар гетерозис әсерін алу үшін селекцияда қолданылады. Бұл өнімділігі жоғары ұрпақты алуды күрт жеделдетуге және жеңілдетуге мүмкіндік береді. Қазір бұл әдістер Қытай мен Өзбекстандағы жібек шаруашылығында кеңінен қолданылады.

Өкінішке орай, жібек құртымен жасалған клондау сәтті жұмыс болып табылса да, басқа жануарлардан клондарды осылайша алу мүмкін емес. Зерттеушілер ұрықтанған жұмыртқадан пронуклеустардың бірін алып тастауға тырысты және екіншісінің хромосомаларының санын бөліну ұршығының микротүтікшелерін бұзатын заттармен өңдеу арқылы екі есе көбейтті. Барлық гендер бойынша гомозиготалы диплоидты жасушалар алынды (құрамында екі аналық немесе екі аталық геномы бар). Мұндай зиготалар ыдырай бастады, бірақ ерте кезеңде дамуы тоқтап, сүтқоректілердің клондарын осылайша алу мүмкін болмады. Пронуклеустарды бір ұрықтанған жұмыртқадан екіншісіне трансплантациялауға әрекет жасалды. Осылайша алынған эмбриондар тек бір пронуклеус жұмыртқаның ядросы, ал екіншісі сперматозоид болған жағдайда ғана қалыпты дамығаны белгілі болды. Бұл тәжірибелер сүтқоректілердің эмбриондарының қалыпты дамуы үшін екі түрлі геном қажет екенін көрсетті – аналық пен аталық. Өйткені, жыныс жасушаларының қалыптасуында геномдық импринтинг – ДНҚ аймақтарының метилденуі орын алады, бұл метилденген гендердің қызметінің тоқталуына әкеледі. Бұл өмір бойына қалады. Аталық пен аналық жыныс жасушаларында әртүрлі гендер өшірілгендіктен, дененің қалыпты дамуы үшін екі геном да қажет – геннің бір жұмыс істейтін көшірмесі болуы керек.

Екінші әдіс – эмбриологиядағы бөлінудің алғашқы кезеңдеріндегі эмбрионды бөлу өте ұзақ уақыт бойы қолданылған, бірақ негізінен теңіз кірпілері мен бақаларда қолданылады. Осылайша, эмбрионнан оқшауланған бластомерлердің толыққанды организмді тудыру қабілеті туралы мәліметтер алынды. Сүтқоректілердің монозиготалы егіздері-клондары кейінірек жасап алынды. Бірақ эмбриондардың жасанды бөлінуі және оларды «суррогат аналарға» имплантациялау, қазірдің өзінде ауылшаруашылық жануарларын өсіруде, ерекше құнды ата-аналардан көптеген ұрпақтар алу үшін қолданылады. 1999 жылы маймыл осы тәсілмен клондалды. Ұрықтандыру пробиркада жүргізілді. Сегіз жасуша сатысындағы эмбрион төрт бөлікке бөлінді және әрбір екі жасушалы бөлік басқа маймылдың жатырына имплантацияланды. Бұл жағдайда үш эмбрион дамымады, бірақ төртіншіден Тетра деп аталатын маймыл дүниеге келді.

Ең танымал клондалған жануар – Долли қойы, ол үшінші әдіспен клондалған. Бұл әдіс – соматикалық жасушаның генетикалық материалын ядросы жоқ аналық жыныс жасушасына тасымалдау.

Ядроларды ауыстырып орналастыру (трансплантациялау) әдісін ХХ ғасырдың 40-жылдарында бақа жұмыртқасымен жұмыс істеген орыс эмбриологы Г. В. Лопашов ойлап тапты. Бірақ ол ересек бақаларды алған жоқ. Кейінірек Дж. Гердон бөтен ядросы бар бақа жұмыртқаларын ересектер пайда болғанға дейін жетілдірді. Бұл керемет жетістік болды. Ол ересек организмнің сараланған жасушаларының ядроларын жұмыртқаға ауыстырды. Ол жүзу торсылдағының жасушаларын және ішек эпителийінің жасушаларын қолданды. Бірақ онда да ересек организмге дейін мұндай жұмыртқалардың 2 %-дан азы ғана дамыды және олардан өскен бақалар қалыпты құрдастарымен салыстырғанда кішірек және тіршілік ету қабілетінің нашарлауымен ерекшеленді.

Ядроны сүтқоректілердің жұмыртқасына трансплантациялау әлдеқайда қиын, өйткені ол – бақа жұмыртқасынан шамамен 1000 есе кішкентай. 1970 жылдары Жаңа-Сібірдегі цитология және генетика институтында керемет ғалым Л. И. Корочкин тышқандарға бұл әдісті жасауға тырысты. Өкінішке орай, оның жұмысы қаржыландырудағы қиындықтарға байланысты жалғасын таппады. Шетелдік ғалымдар зерттеуді жалғастырды, бірақ ядро трансплантациясы операциясы тышқанның аналық жыныс жасушалары үшін тым ауыр болып шықты. Сондықтан экспериментшілер басқа жолын таңдады, яғни олар өз ядросы жоқ аналық жыныс жасушасын бүтін, бұзылмаған соматикалық жасушамен біріктіре бастады.

Доллиді клондаған Я. Вилмут бастаған Шотландиядағы Рослин институтының зерттеушілер тобы жасушаларды біріктіру үшін электрлік импульсті пайдаланды. Олар жетілген жұмыртқадан ядроларды алып тастады, содан кейін микропипетканы пайдаланып, жұмыртқа қабығының астына қойдың сүт безінен бөлінген соматикалық жасуша енгізілді. Электрлік соққының көмегімен жасушалар біріктіріліп, олардың бөлінуі ынталандырылды. Содан кейін, жасанды жағдайда 6 күн өсіргеннен кейін, морула сатысында дами бастаған эмбрионды арнайы дайындалған басқа тұқымды қойдың жатырына имплантациялады (генетикалық материал донорынан фенотиптік жағынан жақсы ерекшеленді). Долли қойының дүниеге келуі үлкен жетістікке айналды, ал кейбір ғалымдар оның шынымен клон екеніне күмәнданды. Дегенмен де, арнайы жүргізілген ДНҚ зерттеулері Доллидің нағыз клон екенін дәлелдеді.

Болашақта сүтқоректілерді клондау техникасы жетілдірілді. Риузо Янагимачи бастаған Гонолулу университетінің ғалымдар тобы өздері ойлап тапқан микропипетканың көмегімен соматикалық жасуша ядросын тікелей жұмыртқаға тасымалдауға қол жеткізді. Бұл оларға тірі жасушалар үшін өте қауіпті электрлік импульссіз жасауға мүмкіндік берді. Сонымен қатар, олар аз сараланған жасушаларды қолданды – бұл кумулус жасушалары (аналық жұмыртқа жасушасын қоршап тұрған соматикалық жасушалар және жұмыртқа жолымен жүру кезінде онымен бірге жүреді).

Қазіргі уақытта осы әдіспен басқа да сүтқоректілер клондалған: сиыр, шошқа, тышқан, мысық, ит, жылқы, қашыр, маймыл.